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即用型免疫组化怎么具体操作

相关实验:石蜡切片免疫组化实验

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张兴伟1997

怎么具体操作

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3 个回答

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泌尿神兽

有帮助

1、脱蜡和水化:脱蜡前应将组织芯片在室温中放置 60 分钟或 60℃恒温箱中烘烤 20 分钟。 a 组织芯片置于二甲苯中浸泡 10 分钟,更换二甲苯后在浸泡 10 分钟 b 无水乙醇中浸泡五分钟 c 95%乙醇中浸泡五分钟 d 75%乙醇中浸泡五分钟 2、抗原修复:用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片: A 抗原热修复 a 高压热修复 在沸水中加入 0.01m 枸橼酸钠缓冲溶液(ph6.0).盖上不锈钢锅盖,但不能锁定。将玻片置于金属染色加上,缓慢加压,是玻片在缓冲液中浸泡五分钟,然后将盖子锁定,小阀门将会升起来。10 分钟后除去热源,置入凉水中,当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。 b 沸热修复 水浴锅加热 0.01 枸橼酸钠缓冲液(ph6.0)至 95℃左右,放入组织芯片加热 10-15 分钟。 c 微波炉加热 在微波炉里加热 0.01 枸橼酸钠缓冲液(ph6.0)至沸腾后将组织芯片放入,断电,间隔 5-10 分钟,胰蛋白酶使用前预热 37℃ 3、免疫组化染色 SP 法(1) 脱蜡、水化(2)PBS 洗 2-3 次各 5 分钟(3)3%H2O2(80%甲醇)滴加在 TMA 上,室温静置 10 分钟(4)PBS 洗 2-3 次各 5 分钟(5)抗原修复(6)PBS 洗 2-3 次各 5 分钟(7)山羊血清封闭液,室温 20 分钟,甩去多余液体(8)滴加 Ι 抗 50μl, 4℃过夜或 37℃1 小时(9)4℃过夜后需在 37℃复温 45 分钟(10)PBS 洗 3 次每次 2 分钟(11)滴加Ⅱ抗 37℃1 小时(12)Ⅱ抗中可加入 0.05%的 tween-20. (13)PBS 洗 3 次各 5 分钟(14)DAB 显色 5-10 分钟,在显微镜下掌握染色程度(15)PBS 冲洗 10 分钟(16)苏木精复染 2 分钟,盐酸酒精分化(17)自来水冲洗 10-15 分钟(18)脱水、透明、封片、镜检。 4、SABC 法(1) 脱蜡、水化(2)PBS 洗 2 次各 5 分钟(3) PBS 配制新鲜的 3%H2O2,室温封闭 5-10 分钟,用蒸馏水洗 3 次(4)抗原修复(5) PBS 洗 5 分钟(6)滴加正常山羊血清封闭液,室温 20 分钟,甩去多余液体(7)滴加 Ι 抗 50μl,室温静置 1 小时或 4℃过夜或 37℃1 小时(8)PBS 洗 3 次各 2 分钟(9)滴加生物素化Ⅱ抗,20℃-37℃ 20 分钟(10)PBS 洗 3 次各 2 分钟(11)滴加试剂 SABC 20℃-30℃ 20 分钟(12) PBS 洗 4 次各 5 分钟(13) DAB 显色:试剂盒或自配显色剂显色(14)脱水、透明、封片、镜检。

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府宅

有帮助

1、石蜡切片,常规脱蜡至水
2、蒸馏水冲洗,pbs 浸泡5 分钟(如需采用抗原修复,在此步骤后进行)。
3、3%双氧水去离子水(无色液体)孵育15-20 分钟,以消除内源性过氧物酶活
性。
4、滴加试剂A(蓝色液体)室温孵育15-20 分钟,倾去,勿洗。
5、滴加适当比例稀释的一抗,37℃孵育2-3 小时或4℃过夜。
6、PBS 冲洗,3 分钟3 次。
7、滴加试剂B(黄色液体),室温或37℃孵育15-20 分钟。
8、PBS 冲洗,3 分钟3 次。
9、滴加试剂C(橙色液体),室温或37℃孵育15-20 分钟。
10、PBS 冲洗,3 分钟3 次。
11、显色剂显色(DAB 或AEC)
12、自来水充分冲洗。
13、如果需要,可进行复染,脱水,透明。
14、选择适当的封片剂封片。

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小布丁瑶瑶

有帮助

1. 脱蜡、水化组织切片

2. PBS洗2-3次各5分钟

3. 根据所应用的一抗的特殊要求,对组织切片进行预处理

4. PBS洗2-3次各5分钟

5. 加入100ul A 液孵育十分钟,阻断内源性过氧化物酶,以减少非特异性背景染色

6. PBS洗2-3次各5分钟

7. 加入100ul B 液孵育五分钟来减少非特异性染色。注意:此步骤不要超过十分钟;如果一抗在含有5%至10%正常山羊血清的缓冲液中稀释,则此步骤可以省略

8. PBS洗2-3次各5分钟

9. 加一抗,室温或37℃孵育20分钟

10. PBS洗2-3次各5分钟

11. 加入100ul C 液孵育十分钟

12. PBS洗2-3次各5分钟

13. 加入100ul D 液孵育十分钟.注意:此液对光敏感,注意避光

14. PBS洗2-3次各5分钟

15. 配制新鲜底物液:将30ul的 F 液和1ml的 E 液充分混合,即配制成新鲜底物液(该底物液可存放2周)

16. 加入100ul新鲜底物液, 孵育五分钟

17. 去离子水冲洗

18. 复染,封片

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