二抗染坏了（非特结了），如何补救? 信号放大过度咋整? 染料和pbs在组织中互相作用的正确步骤?

1) 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7．4)冲洗三次，每次3分钟(3×3’)。

　　2) 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。

　　3) 每张切片加1滴或50ul过氧化酶阻断溶液(试剂A)，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10分钟。

　　4) PBS冲洗3×3’。

　　5) 甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul的非免疫性动物血清(试剂B)，室温下孵育10分钟。

　　6) 甩去血清，每张切片加1滴或50ul的第一抗体(用户自选)，室温下孵育60分钟或4℃过夜，建议参阅每种抗体的说明书。

　　7) PBS冲洗3×5’。

　　8) 甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul生物素标记的第二抗体（试剂C），室温下孵育10分钟。

　　9) PBS冲洗3×3’。

　　10)甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂D)，室温下孵育10分钟。

　　11)PBS冲洗3×3’。

　　12)甩去PBS液，每张切片加2滴或100ul新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜下观察3—10分钟，阳性显色为棕色或红色。

　　13)自来水冲洗，苏木素复染，0.1％HCL分化，0.1％氨水或PBS冲洗返蓝。

　　14)如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水，而直接用水性封片剂封片。