求助质粒转染问题，要做鱼类细胞稳转
XJJyyds
质粒是pEGFP-N1，目的基因是Bax，转染的是异育银鲫尾鳍细胞系贴壁细胞（我们实验室自己构建的），转染（转染试剂是lip3000）做了很多次去年十二月底转的一次重组质粒能看到绿色荧光，刚要用G418筛自己阳了，后面恢复了之后就再也没转进去过。现在老师开组会每次都要汇报进展，真的很头疼。
目前转染的情况是转染空质粒能看见一些荧光但效率也很低，转重组质粒一点也看不见，而且不管是转染空质粒和重组质粒细胞死亡都挺多的。
查了一些文献有的做稳转在转染之前把重组质粒线性化再做，我想求助有没有这个必要呢？还有就是现在怎么转都转不进去能请教一下大家的经验吗？
4 个回答
毛利小五郎的徒弟
建议更换质粒，这个质粒时间长很有可能已经失效了
sswei
传染失败，主要有三个原因：
1： 细胞本身难转，查资料看，这个细胞好转吗，用什么试剂。
2：质粒质量不好，质量差的质粒，是转不进去，或者表达不了的。
3：其他原因。比如，细胞状态不好，试剂过期等等。
loveliufudan
质粒转染是细胞实验中的一个关键步骤，如果出现问题可能是多方面原因导致的。以下是一些可能的解决方案，供您参考：
尝试不同浓度的转染试剂。您可以尝试使用不同浓度的lip3000试剂来转染细胞，可能需要进行一定的优化才能找到最适合您的实验条件。
尝试使用不同的转染试剂。如果lip3000试剂无法转染您的细胞，请尝试使用其他品牌的试剂。
尝试使用不同的细胞。不同类型的细胞对转染试剂的敏感性可能不同，您可以尝试使用其他细胞系进行转染，比如HEK293T。
尝试使用线性化的质粒。将质粒线性化可以增加转染效率，因为线性化的质粒更容易进入细胞核。
尝试优化转染条件。您可以尝试优化转染的时间、温度和细胞密度等条件，以提高转染效率。
检查质粒的纯度。如果质粒的纯度不高，其中可能会包含有害物质，可能会影响转染效率。您可以尝试纯化质粒，或使用商业提供的高质量质粒。
检查细胞的健康状况。细胞的健康状况可能会影响转染效率。请确保细胞处于良好的生长状态，没有感染等问题。
至于您提到的线性化质粒的问题，线性化质粒能够提高质粒的转染效率，但是否必要取决于您的实验。对于某些实验，线性化质粒并不是必需的，但对于一些难以转染的细胞系，线性化质粒可能是必须的。
huarenqiang5
你这个情况还是建议做稳转在转染之前把重组质粒线性化再做。
