Elisa实验皮肤样品匀浆处理。

50mg组织加1mlpbs和10ul蛋白酶抑制剂

50mg组织加1ml处理液就可以

1、刚取得的新鲜组织样本用PBS 洗净。

2、准确称取 50mg 组织，加入 1ml 匀浆缓冲液A，用玻璃匀浆器充分匀浆。

3、在 100×g，4℃离心 3 分钟，弃沉淀，取上清。样本检测：

1、在 96 孔板中加入 200μL 匀浆上清液、2μL DHE 探针，用移液器吹打，使之充分混匀。

2、在 37℃避光孵育 30 分钟。

3、置于荧光酶标仪中，后于激发波长为 488-535nm、发射波长 610nm 检测荧光强度。蛋白定量：

1、另取 50μL 上清匀浆液，用 PBS 大约稀释 30 倍。

2、取 100μL 进行蛋白定量。结果处理：

以荧光强度/毫克蛋白表示组织活性氧强度。

应用 TRIPURE 提取蛋白质步骤：含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml 每 1mlTRIPURE 用量）

倒转混匀，置室温 10min

离心：12000 g，10min，4 度，弃上清

加入 0.3M 盐酸胍/95％乙醇：（2ml 每 1mlTRIPURE 用量）

振荡，置室温 20min

离心： 7500g，5 min，4 度，弃上清

重复 0.3M 盐酸胍/95％乙醇步 2 次

沉淀中加入 100％乙醇 2ml

充分振荡混匀，置室温 20 min

离心： 7500g，5min，4 度，弃上清吹干沉淀

1％SDS 溶解沉淀

离心：10000g，10min，4 度

取上清-20 度保存（或可直接用于 WESTERN BLOT）

存在的问题：加入 1％SDS 后沉淀不溶解，还是很大的一块，4 度离心后又多了

白色沉定，SDS 结晶？测浓度，含量才 1mg/ml 左右。

解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加 2X BUFFER，然后煮5－10 分钟，效果很好的。