样品的前处理

 

第四节　样品的前处理

样品的正确收集与处理，是蛋白质及多肽激素放射免疫分析取得成功的前提。不同的样品与测定项目，其前处理有不同的要求。下面以神经肽测定为例，介绍样品的前处理方法。

一、脑、脊髓与垂体中神经肽的提取（以大鼠为例）

1．大鼠称重后，在尽量安静的情况下，迅速断头、取躯干血。

2．尽快取下全脑、脊髓（某段）与垂体，在沸生理盐水中煮5min，以灭活酶，保持神经肽的稳定。

3．根据实验要求分出脑区（如小脑、桥延脑、下丘脑、中脑或中央灰质、丘脑、皮层、海马、纹状体等与垂体前叶。

4．脑区等称重。

5．把脑区、垂体或脊髓，分别置于玻璃匀浆管内，加入1mol/l HAC（或HCl）1ml，充分匀浆后倒入塑料指形管中，在室温下放置100min，使生物活性物质充分溶解在酸中。

6．加入1mol/l NaOH 1 ml，中和酸。

7．离心，取上清。

　　8．低温（-20 ^℃ 以下）保存待测。

二、大鼠脑神经核团微穿孔取样方法（以下丘脑为例）

1．大鼠迅速断头，取出全脑，置沸生理盐水中煮5min。

2．将全脑置于取材角度器上，分别于视交叉前和乳头体后用双面刀片垂直切断，取下丘脑块。

3．将双面刀片装在切片机上。

4．将下丘脑置于切片机机载物台上，腹侧向下，并用502胶水固定。在脑块后方适当放置琼脂块以利固定。

5．开动振动切片机，缓慢移动推进器，切片厚400～500μm。用毛笔沾生理盐水，小心收集切片置于平皿内的生理盐水中。

6．将脑切片平置于橡皮板上，并在体视显微镜下，参照鼠脑立体定位图谱，确定神经核团位置。

7．选择相应直径的穿孔器，分别于两侧核团上垂直插下，然后推出针蕊将所取核团组织放入匀浆器中。

8．加入1mol/l HAC 0.5ml, 充分匀浆后倒入放免测定管中，放置100min。

9．加入1mol/l NaOH 0.5ml中和酸，离心（3000rpm/min）20min，取上清液，低温保存待测。

三、内脏、肿瘤组织中神经肽的提取（以胃粘膜为例）

（1）取下胃粘膜后，迅速称重置于试管，中沸蒸馏水1ml，在水浴中煮100min。标本在室温下放置，其中的生物活性物质会被酶降解，所以要立即加热处理。

（2）冷却后倒入特殊的匀浆器中，充分匀浆（使用电动搅拌器）。匀浆液倒入塑料指形管中，再用蒸馏水1ml，冲洗匀浆器，并倒入上述管中。

（3）离心，取上清，低温保存待测。

四、血浆

1．直接测定

（1）加酶抑制剂：准确采全血若干毫升，注入预冷的加有①抗凝剂0.3mol/l EDTA・2Na（乙二胺四乙酸二钠）溶液（每毫升全血20μl）、或1%肝素（每毫升全血10μl）；②抑肽酶（每毫升全血500单位）的塑料指形管中，迅速低温离心，取血浆低温保存待测。

抑肽酶有液体的（标签写的有每毫升含多少单位）与固体的（每毫升含12TIU，1TIU=900KIU，即每毫克含10800单位）。固体的抑肽酶可用生理盐水溶解，使之每20μl含500单位。

（2）酸化处理：每毫升血浆加1mol/l HCl 0.2ml，低温保存待测。测定前加1mol/l NaOH 0.2ml。

以上两种方法，任选一种即可。

2．间接测定血标本经提取后，可去除蛋白质等干扰因素，并使微量的生物活性肽浓缩，但较费时，成本也高。常用的提取方法有：

　　（1）柱层析提取法：有多种层析柱可供提取不同的神经肽，其中较为方便的是用Sep-pak C ₁₈ 层析柱提取。主要步骤步：

①柱的预处理：该柱有两头，长头连接注射器，可注入溶液与样品，短头为排出口。预处理时注入乙腈10ml。蒸馏水20ml，使柱中的生物胶活化。

②注入样品（如血浆、脑脊液、腹水、尿等）：样品中的水份流出，生物活性肽、蛋白及杂质等吸附在生物胶上。血浆上柱前，如先去除蛋白，可增加柱子的使用时间。]

③淋洗：用4%HAC溶液100ml注入柱中，以洗去一些杂质。

④洗脱：用7ml酸性乙腈（按容积算，每100ml中含有乙腈75ml、HAC4ml、蒸馏水21ml）作为洗脱剂，注入柱中，把生物活性肽洗脱下来，收集在塑料指形管中。

⑤清洗：用乙腈、蒸馏水清洗柱子，以备后用。

⑥将洗脱液吹干，低温保存待测。测定时可加入一定量的缓冲液溶解。

　　Sep-Pak C ₁₈ 柱层析，也可用于制备标记抗原时的层析纯化。

　　（2）加膜 藻 土提取法：

①抽血：用一次性塑料注射器抽取受试者静脉血4ml，置于加有肝素（125单位/ml 全血）指形管中。

　　②分离血浆：在4 ^℃ 下离心，取出血浆。

③血浆酸化：取2ml血浆，加入1mol/l HCl 0.5ml, 摇匀。

　　④吸附：加入0.5% 藻 土悬液2ml，在水平震荡器上震30min。离心，去上清，留沉淀。

　　0．5% 藻 土县液（Fuller’s earth)的配制：

0.5g Fuller’s earth

　　0.1g Dextran T ₇₀

100ml去离子水

⑤洗脱：在沉淀管中加入80%酸性丙酮1ml，在漩涡振荡器上振2min，离心，取上清置于经硅化的玻管中。

80%酸性丙酮的配制：

80ml丙酮

20ml 1mol/L HCl

⑥去脂：加入石油醚1ml，摇匀，脂肪溶解在石油醚中，分层后吸去上层。

⑦干燥：下层液体，置于37℃水浴中，用氮气（或空气）吹干。

⑧低温保存待测。测定时用一定量缓冲液溶解。

（3）有机溶剂提取法：常用的有甲醇、乙醇、乙腈、丙酮等。将溶剂按一定比例，加入标本内，混匀、振荡、离心，取上清吹干，冷藏待测。通常在有机溶剂中加入适量的酸。

　　在这些方法中，以柱层析法最稳定、准确，但成本高，推广不易。加膜 藻 土法，提取率较高，但操作复杂、费时。有机溶剂提取法操作方便，成本也低，虽稳定性较差。

五、脑脊液

1．煮沸收集脑脊液时，管子浸在冰水中。收集完毕，立即在沸的水浴中煮5min。离心、取上清；低温保存，待测。

2．酸化在1ml脑脊液中加入1mol/l HCl 0.2ml；测定时，再加入1mol/l NaOH 0.2ml中和。

3．加酶抑制剂

4．柱层析提取

以上方法，任选一种。

六、尿

尿液收集于事先加有适量醋酸或盐酸的容器中，使pH达4左右，煮沸1～2min，冷却后离心，取上清，加适量NaOH液，使尿液pH达7.0左右。此尿即可用于直接测定或经提取后再测定。

　　尿认提取法相同。采用Sep―Pak C ₁₈