蛋白免疫印记实验中，无蛋白的区域具有高背景，洗涤非常充分，孵化温度也比较合适，会是什么原因

可能是封闭液的原因，封闭液的浓度偏低，封闭时间过短，导致封闭不彻底，抗体与酶标板孔结合，也可能导致无蛋白区域背景偏高。

高背景可能是因为封闭不好：蛋白质转印到PVDF 膜或 NC 膜后，泳道与泳道间的空隙没有蛋白质；这时我们需要藉由额外的蛋白质缓冲液来填补其空白处。由于抗体本身也是一种蛋白质，因此若封闭作用不足，抗体可能会填进空白处的位置，进而造成高背景的结果。

高背景的原因可能有以下几种：

蛋白过度固定：过度固定样品可能导致非特异性结合和高背景。建议优化固定条件，包括浓度、固定时间和温度等。

阻断剂过多：阻断剂过多可能会导致非特异性结合和高背景。建议减少阻断剂的使用量，或者尝试其他的阻断剂。

抗体浓度过高或过低：抗体浓度过高或过低可能会导致高背景。建议优化抗体浓度，并进行适当的稀释。

试剂过期或存储不当：试剂过期或存储不当可能会导致高背景。建议检查试剂的保存时间和条件，并使用新鲜的试剂。

其他污染：除了上述原因外，其他可能导致高背景的污染因素包括：非特异性结合的二抗、酶标记物或基质、旧的或污染的装备或试剂等。建议仔细检查所有试剂和装备，确保其纯度和新鲜度。