肝星状细胞提取

直接看丁香园的帖子就好。

材料

相差显微镜，荧光显微镜，手术器械，雄性SD大鼠，体重250-450 g，戊巴比妥钠，200目尼龙网，小牛血清（或胎牛血清，则更好），DMEM，胰酶消化液（以HBSS配），Nycodenz（以GBSS配），D-Hanks'（KCl 0.4 g/L，KH2PO4 0.06 g/L，NaCl 8.0 g/L，NaHCO3 0.35 g/L，Na2HPO4.7H2O 0.06 g/L或Na2HPO4 0.053 g/L，可加酚红 0.02 g/L），HBSS，台盼兰等。

方法

大鼠腹腔麻醉-->剖腹-->门静脉插管-->D-Hanks'液灌注，同时剪开下腔静脉-->灌以胰酶消化液-->离体肝脏并剪碎-->继续消化-->以尼龙网过滤-->450 g X 5'（4度，下同）-->ppt以HBSS重悬-->混以Nycodenz液-->转至离心管，并覆以HBSS-->1450 g X 16'-->取界面细胞-->重悬、离心收集细胞-->细胞计数，并判断存活率和产量-->按照常规接种-->次日换液。

传代方法：弃培液-->以D-Hanks'液洗两次-->0.125％胰酶（原代最好加0.05% EDTA）消化-->镜下观察细胞突起回缩（2-5分钟左右）-->以完全培液（DMEM+10% NBS）终止反应（若不用EDTA，可以不需离心）-->吹打，1:2-1:3接种，然后继续培养（5% CO2，37度）

大鼠腹腔麻醉-->剖腹-->门静脉插管-->D-Hanks'液灌注，同时剪开下腔静脉-->灌以胰酶消化液-->离体肝脏并剪碎-->继续消化-->以尼龙网过滤-->450 g X 5'（4度，下同）-->ppt以HBSS重悬-->混以Nycodenz液-->转至离心管，并覆以HBSS-->1450 g X 16'-->取界面细胞-->重悬、离心收集细胞-->细胞计数，并判断存活率和产量-->按照常规接种-->次日换液。

1、麻醉及门静脉、下腔静脉插管。

2、灌注液灌注:分为原位及离体灌注。

3、酶消化液循环灌注。

4、振荡消化液振荡消化:将分散的肝组织细胞放三角烧瓶中37C进一步振荡消化。

5、过滤:200目筛网过滤

6、离心:根据酶消化液的不同及采用密度液的不同,离心方法各异。差别在于未采用链蛋白酶者改用2次50g离心以去除肝细胞

7、取沉淀即HSC培养。

1. 大鼠腹腔麻醉后在超净台上剖腹，进行门静脉插管。

2. 以D-Hanks‘液灌注，同时剪开下腔静脉，冲掉血液后，改灌以100 ml 酶消化液I(0.05% IV 型胶原酶)。

3. 待肝脏变软后，离体肝脏并剪碎，继续以酶消化液II(含20U/ml DNase I 的0.05% IV 型胶原酶)消化15 min，尼龙网过滤后以450 g 离心5 min(4℃，下同)。

4. 以HBSS 重悬沉淀至10 ml，再混以20 ml Nycodenz 液，分置于离心管中，并分别覆以2-3 ml HBSS，1450 g 离心16 min 后取界面细胞。

5. 以HBSS重悬后再次离心收集细胞，以DMEM重悬后进行细胞计数，并判断存活率和产量，最后按照常规方法接种(105 细胞/cm2 )，次日换液，以后每2-3 天换液一次。

6. 传代方法：弃去培液后以D-Hanks’液洗两次，加0.125%胰酶(原代最好加0.05% EDTA)消化，镜下观察细胞突起回缩(2-5 min左右)，以完全培液(DMEM+10% NBS)终止反应(若不用EDTA，可以不需离心)， 充分吹打后以 1:2-1:3 接种，然后继续培养(5% CO2，37℃)。