HMGB1对肝星状细胞细胞外基质合成的影响

【摘要】

目的：探讨高迁移率族蛋白B1（HMGB1）对肝星状细胞(hepatic stellate cell HSC)合成细胞外基质(extracellular matrix ECM)的影响。

方法：剂量效应组分别用含HMGB1 0 mg/L,0.1 mg/L,1.0 mg/L,10 mg/L，20 mg/L和40 mg/L的HMGB1培养液培养HSC-T6 6 h；时间效应组以含有10 mg/L HMGB1的培养液培养0 h、6 h、12 h、18 h和24 h,对照组以不含HMGB1的培养液分别培养HSC-T6细胞，留取各组培养液离心后的上清，用双抗体夹心ELISA方法检测其上清中PⅢP和CⅣ的含量。

结果：对照组HSC-T6细胞ECM分泌量较低；HSC-T6的ECM分泌量与HMGB1呈剂量依赖关系(r=0.835,0.955，P<0.05)；10 mg/L HMGB1时间效应组的PⅢP,CⅣ分泌量在18 h和24 h 均明显高于对照组（P<0.05）。

结论：HMGB1能诱导HSC-T6细胞分泌ECM，可能在肝纤维化的发生、发展中发挥重要作用。

目前认为，HSC的激活是肝纤维化发生发展的关键环节^[1] ，HSC激活的始动因素是肝损伤和炎症反应，而HSC激活的过程包括早期启动激活和后期“持久化”激活，激活的“持久化”是维持HSC激活状态及产生ECM的必要条件。多种急性肝损伤因素虽能引发早期启动激活，但因为缺乏“持久化”激活因素，所以不会导致肝纤维化或肝硬化的发生（如HAV/HBV引起的急性肝炎），而各种慢性感染或慢性炎症反应能持续激活HSC （如 HCV/HBV引起的慢性肝炎），因此，慢性炎症反应的持续存在是HSC激活“持久化”的基础。

近年来，随着对炎症反应认识的深入，人们发现了一种有效的炎症介质HMGB1,它具有较其他细胞因子释放晚和作用时间长的特点^[2] 。那么HMGB1是否对肝纤维化的发生、发展发挥重要作用呢？我们课题组的先前研究表明在肝纤维大鼠的肝组织中HMGB1的表达明显增强，但HMGB1是否通过激活HSC参与肝纤维化的发生发展目前尚不清楚，本研究拟通过HMGB1刺激HSC以观察ECM的合成情况来进一步探讨HMGB1与肝纤维化的关系。

1 材料与方法

1.1 主要试剂
HMGB1由本室制备保存；新生胎牛血清（FCS）为杭州四季青生物工程材料研究所产品；高糖型DMEM购自英国Gibco公司；大鼠PⅢP ，CⅣ双抗体夹心ELISA检测试剂盒购自上海晶天生物科技有限公司（进口分装）；HSC-T6细胞株由北京地坛医院肝病研究所惠赠。
1.2 实验分组及处理
大鼠HSC-T6细胞系在含10%的胎牛血清的DMEM培养基中培养传代4次至对数生长期,调整细胞数为2×105密度接种于6孔培养板中,每孔1 mL,细胞贴壁后改用2%的胎牛血清的DMEM培养液同步饥饿培养2 h,使培养细胞处于G0期后做下面实验：
1.2.1 HMGB1的剂量效应组：分别用含有0 mg/L、0.1 mg/L、1.0 mg/L、10 mg/L 、20 mg/L和40 mg/L的HMGB1培养液培养HSC-T6，6 h后,收集HMGB1刺激孔及对照孔培养上清液，用双抗体夹心ELISA法测HSC-T6培养上清液中PⅢP，CⅣ的含量。以上每组均设3个复孔，具体操作严格按照试剂盒说明进行。
1.2.2 HMGB1的时间效应组：刺激组（10 mg/L HMGB1）和正常对照组（等量的PBS）分别用含10 mg/L HMGB1和等量的PBS的DMEM培养液培养HSC-T6细胞0 h、6 h、12 h、18 h和24 h,同上收集培养上清液 用双抗体夹心ELISA 方法测HSC-T6培养上清液中PⅢP ，CⅣ的含量。以上每组均设3个复孔，具体操作严格按照试剂盒说明进行。
1.3 统计学方法
　采用SPSS12.0统计软件，进行Spearman相关分析，单因素ANOVA(方差分析)，两样本比较采用LSD-t检验，实验数据均以(x±s)表示,P＜0.05判定有显著性差异。

2 结果

2.1 HMGB1对 HSC-T6分泌PⅢP、CⅣ的剂量效应
HMGB1能促进HSC-T6分泌PⅢP、CⅣ，在一定浓度范围内（0.1 mg/L～10mg/L）呈剂量依赖关系（r=0.835，0.955，P<0.05），当HMGB1浓度为10 mg/L时，HMGB1显著促进HSC-T6分泌PⅢP、CⅣ并达峰值，当HMGB1浓度为20 mg/L时，HSC-T6 PⅢP、CⅣ的分泌量与10 mg/L时相当，HMGB1浓度为40 mg/L时分泌量下降。（见表1)表1 不同剂量的HMGB1对HSC分泌ECM的影响。
2.2 HMGB1对HSC-T6分泌PⅢP,CⅣ的时间效应
刺激组HSC-T6分泌PⅢP、CⅣ在0 h～24 h间呈递增趋势,随着时间的延长增加,呈时间依赖关系(r=0.970，0.982，P<0.05)，正常对照组上清液PⅢP、CⅣ含量变化趋势与HMGB1刺激组一致。在6 h和12 h两组上清液PⅢP、CⅣ的含量无显著差异（P>0.05），但在18 h、24 h刺激组上清液PⅢP,CⅣ含量明显高于正常对照组（P<0.05）。

3 讨论

目前认为HSC在肝纤维化的进程中起重要的作用,在慢性损伤因素的持续作用下,肝脏内大量的细胞因子分泌，其中最主要的有TGF-β、PDGF等^[3]，可以使静止的HSC活化、增殖，产生大量的细胞外基质(ECM)沉积于肝组织,由于其在肝纤维化中的特殊性地位。因此，体外培养HSC常作为肝硬化基础及实验治疗研究的重要手段^[4-11] 。