WB杂带多怎么回事，做了好多次都是

.1.原因：细胞系传代次数过多，蛋白表达谱发生变化。

建议：使用未传代或传代次数较少的细胞系（不超过15代）进行样品制备。

. 2 .原因：与细胞系裂解物相比，原代细胞或组织提取物会倾向于有较高的背景和降解条带。

建议：1. 用新鲜提取的，经过超声处理的澄清的组织提取物能降低背景。

2. 同时，用去垢剂含量较高的RIPA buffer裂解组织，可得到裂解更彻底、一致性更高的裂解物。

. 3 .原因：蛋白被降解。

建议：1. 提取液确保含有蛋白酶抑制剂，并超声；

2. 蛋白样品提取后分装－20℃或－80℃短期保存，避免反复冻融，有条件尽量用新鲜提取的蛋白。

. 4 .原因：蛋白本身有很多修饰。

建议：查阅文献，确定目的蛋白是否存在多种修饰，泛素化、糖基化等修饰会让蛋白的条带发生较大的偏移。

. 5 .原因：所检测蛋白存在多种剪接体，导致分子量大小不同。

建议：查阅文献或者通过搜索数据库来确定该蛋白是否存在多种长度不同的编码mRNA。

. 6 .原因：蛋白存在二聚体或多聚体。

建议：SDS loading buffer中现用现加β－巯基乙醇或DTT。

. 7 .原因：样本存在外源转入蛋白。

建议：检查所用样本是否有过被外源进去带有标签的靶标蛋白。如有，更换细胞系样本。

. 8 .原因：上样量过多。

建议：根据靶标表达情况，梯度上样跑胶后选择合适的上样量，通常20-50µg即可。

. 9 .原因：实验操作与CST推荐的步骤有较大出入。

建议：1. CST推荐封闭液用5%脱脂奶粉／TBST，室温1h；

2. 一抗稀释液、稀释比参考抗体说明书，推荐4℃过夜孵育；

3. 二抗用5%脱脂奶粉／TBST稀释，工作浓度切忌过高，室温孵育1h；

4. 要用1XTBST缓冲液充分洗涤。

1.如果你的主带很明显，杂带趋势又一致，你就忍了吧。2.可以切一下膜，把杂带的位置切掉。3.换家公司买抗体。或者是换个批号试试。

可能的原因及建议：

①目的蛋白存在多个修饰位点(磷酸化位点、糖基化位点等等)，本身可以出现多条带。查文献或生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，去除修蛋白饰后确定蛋白实际大小，这个需要一定的生物化学基础和生信分析能力。

②目的蛋白有其它剪切本，查阅文献或生物信息学分析其可能性。

③样本处理过程中目的蛋白发生降解，加入蛋白酶抑制剂；样本处理在冰上操作。

④上样量过高，过于敏感，适当减少上样量。

⑤一抗特异性不高，重新选择或制备高特异性的抗体。

⑥一抗不纯，纯化抗体。

⑦一抗或者二抗浓度偏高，适当降低抗体浓度。

1、更换一抗，换单克隆的。

2、不换一抗，降低一抗稀释比，这样目的条带会变弱，不过杂带也会，有时候就可以去掉杂带了。

3、多封闭一下。

4、洗膜的时候多洗几次。

原因分析：

1.样品有降解； 目标蛋白有剪切活化；目标蛋白有修饰； 目标蛋白是可能存在二聚体、多聚体形式；目标蛋白是否存在多种isoform；

2.可能是样品材料出错，样品制备方法不正确； 所用细胞可能传代过多积累突变

杂带原因：一抗特异性不高，存在交叉反应；二抗特异性可能有非特异性结合，可不加一抗验证；可能是一抗二抗浓度过高； 上样量过大； 封闭不足；