如何才能跑满意的蛋白条带？求解决方法

WB实验要做的好，有以下几点需要注意：1. 样品质量。所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。这会直接影响到样品浓缩的效果。此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。

2. 凝胶质量。不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，分离胶的PH值应在8.8左右，而浓缩胶的PH应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位，因为这个PH条件是保证电泳液中的甘氨酸不电离的必要条件，也是保证能充分压缩样品的前提。因此，制备凝胶的时候所用Tris-HCl缓冲液的PH值是否稳定是很重要的。

3. 点样。样品尽量不要与电泳液混合，这样能提高浓缩的效果，因为电泳液PH值为8.3，而样品为7.5，混合后会影响到样品的PH值，进而影响浓缩效果。因此，建议点样最好用长枪头，或者加样器，轻轻的将样品加到孔的底部。

4. 电泳缓冲液。尽量用新鲜配制的。这样能保证PH值和离子强度的稳定。

5. 电压条件。我们经常用的浓缩时80V，分离时100V比较好，条带很平。

6. 转膜。膜的选择主要从实验目的和实验要求来考虑。例如，要做分子量小于20kD的小蛋白，0.45μm的NC膜是不可取的，因为这样可能会使得蛋白因透过膜孔而造成膜结合的目的蛋白量不确定，从而影响到最终结果的可靠性。而如果所分离的蛋白需要进行测序，则非PVDF膜不可，因为只有PVDF膜才能经受住严酷的清洗条件。

7. 抗体杂交与底物显色。一抗尽量选择小鼠或者兔来源的单克隆抗体，还有要注意所用的抗体是否能够识别变性条件下的目标蛋白；二抗一般都是效价很高的，只要室温下杂交1小时就可以了，适当延长也是可以的。另外，要选择灵敏度较高的化学反应底物。如英格恩生物的超敏型ECL发光液Enlight-Plus，检测级别可达pg级，发光时间长，稳定。

1.清洁的实验器材

2. 摇动和搅拌

3.保持试剂新鲜

4.低电压慢跑

5.上样要适中

(1)蛋白收集及定量:首先，自己的蛋白定量是否精准?线性回归几个9?(至少要2个)其次，收集蛋白上清时，切记切记:tips不能触碰到沉淀或吸取少许沉淀!因为哪怕是一点点沉淀都会导致该样品的蛋白浓度不均，严重影响蛋白定量的精准性。

(2)上样时要保证各组蛋白浓度一致，同体积或同质量。同时，小心上样，避免蛋白丢失，即有些蛋白加到槽外。

(3)转膜时(湿法或半干转法)，特别是半干转法，务必保证上下层滤纸充分浸泡在转膜液中，使之达到饱和!滤纸放到转膜仪上要设法保证滤纸的平整。滤纸与滤纸之间滤纸与PVDF膜之间尽可能的驱赶气泡!(4)抗体:一抗用过3次往后就不要用了。直接换新的。