包涵体的纯化相关问题
丁香实验
最近在纯化一个GST标签的蛋白，需要用目的蛋白去免疫动物，前期摸条件的时候，发现不管是低温诱导还是37℃诱导，或者是改变IPTG的浓度，破完菌后，目的蛋白在沉淀里面表达都是多很多，我想问一下各位前辈，是破完菌后再用尿素进行溶解破菌沉淀吗？破完菌用尿素溶解后，我直接去与GST进行结合吗（也就是开始纯化了）？我看有说要复性，想问问怎么个前后顺序，复性的话有protocol吗？ 
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29 个回答
dxyhsx123
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先破菌，去上清，在洗涤，再用尿素溶解。一些浓度和时间，根据实验进行摸索。
z流沙z
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首先要破菌好，可以反复冻融一下然后超声裂解，再用尿素进行包涵体溶解，然后对蛋白质进行复性，再进行蛋白质纯化
JCorona
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可以参考冷泉港的《分子克隆实验指南》，有中译本。里面的参考方法是裂解细菌后离心弃上清，然后摸索尿素的浓度，确定最佳浓度后用含尿素的缓冲液重悬沉淀。溶解后可以直接开始纯化。
lzy必有我师
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既然决定变复性，就先换个Tag吧，推荐His。 先破菌，然后离心去掉上清，buffer洗一洗，然后再超声一下，再洗洗。最后沉淀留着。 然后加8M Urea/6M GuanHCl +pH（7-8） buffer 去重溶解，再离心去掉不可溶沉淀。 直接上Ni beads 像普通纯化一样，洗脱选用低pH（4-5） buffer。 咪唑没用了。 GST tag做变复性也不是不行，就是变性下tag 结合不了beads。但是His 可以。 洗脱液得到后就可以直接透析复性，最好设置一个Urea梯度透析
内科小护士
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这个颜色问题好象没有影响吧，只要样品离心了，过滤了，不堵柱子，不是沉淀，上柱没问题，我上次将这种状态的上清过柱子了，结果柱子颜色变褐色了，倒是没堵。但是柱子的结合力下降了。
是小杨同学
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可以使用尿素溶解，溶解后进行纯化，纯化后就可以复性了
vae1476
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有试过his tag 吗？GST的tag需要复性后再纯化，his的不需要，建议尝试
ZZDX-YILILI
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我看图中还是在沉淀中比较多的，也就是最好需要进行包涵体裂解。裂解完之后用尿素进行包涵体溶解。下一步就是对蛋白质进行复性。最好才是利用标签蛋白进行蛋白质纯化。
dxy_rlratyf3
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可以使用尿素溶解破菌沉淀，不过盐酸胍更优一些。破菌沉淀确实需要复性，但是沉淀里还有很多杂质，需要先用一些洗涤剂比如在50mM Tris，1mM EDTA， pH 7.0-8.5中的2M尿素（过高浓度尿素会让包涵体溶解）除去包涵体上的杂质，再用盐酸胍（6M）溶解，最后复性就是缓慢降低盐酸胍的浓度让蛋白重新折叠，一般稀释法稀释到1.5M盐酸胍的时候复性就结束了。Protocol的话搜索包涵体蛋白稀释复性法就可以了。
verbalkint
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8M尿素变性沉淀，然后复性，然后才能获得有活性的蛋白去做实验。这里有一个简单的介绍。http://www.friendbio.com/meansMore/id/27
医往情深丁香园
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破菌不完全不只是指菌体没有破开,还包括菌体虽然已经破开,但是核酸还不够破碎,即形成的核酸片段较大.你所说的这种情况属于后者,造成过大的核酸片段和蛋白结合,同时尿素溶解时会造成出现粘粘的感觉.因此,建议:
1.破菌前先在-20度将菌体冻实,然后再融开破菌.
2.破菌液中加0.1mg/ml的溶菌酶,37度搅半至粘稠,然后粘稠的破菌液变的较稀时再超声,可适当加大超声的功率60HZ应该足够了.
3.超声后,镜检,确保菌体破菌率95%以上.
4.菌体大部分破裂后,加10微克/毫升的DAN酶1,搅拌45分,使大的核酸片段断裂成小片段,然后再离心
一支肾上腺素
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我觉得是你的蛋白没有变性好才会出现这种情况，更换一下你的变性液，或者改变变性条件试试。
dxy_qkedgrg7
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使用尿素溶解是可以的，溶解完就可以进行纯化了，然后需要进行复性
dxy_bq4uxnd
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可以使用尿素溶解，也可以使用一些蛋白保护液溶解，溶解后就可以开始纯化了，使用尿素溶解需要复性，不使用尿素一般不需要复性。
dxy_w4oj7yoe
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个人觉得可以先尝试优化蛋白可溶性，比如稍微截掉几个氨基酸，或者使用MBP之类更加促溶的tag，也可以尝试昆虫或哺乳动物细胞等更高等的表达体系。为了纯化得到目的蛋白，肯定优先让它表达出可溶蛋白会更好。
如果一定要纯化包涵体，可以使用尿素或盐酸胍溶解，需要复性后才能进行亲和层析，详细纯化方法可以参考以下网站 或者在ncbi上找找相关文献
http://www.detaibio.com/topics/inclusion-body-refolding-introduction.html
jey1235
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看情况是不可溶的表达。
既然决定变复性，就先换个Tag吧，推荐His。
先破菌，然后离心去掉上清，buffer洗一洗，然后再超声一下，再洗洗。最后沉淀留着。
然后加8M Urea/6M GuanHCl +pH（7-8） buffer 去重溶解，再离心去掉不可溶沉淀。
直接上Ni beads 像普通纯化一样，洗脱选用低pH（4-5） buffer。 咪唑没用了。
GST tag做变复性也不是不行，就是变性下tag 结合不了beads。但是His 可以。
洗脱液得到后就可以直接透析复性，最好设置一个Urea梯度透析。一般就完事了
dxy_h7vcp8v3
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包涵体的话一般不好纯化。可以尝试其他促溶标签例如MBP，如果，非要纯化。先用加尿素的缓冲液通过超声破碎让蛋白释放出来，然后正常过纯化柱子，正常洗脱，然后洗脱的蛋白，采用透析去掉尿素，然后超滤浓缩复性蛋白
小狐狸FI3I
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1.如果洗脱组分不纯，可增加洗杂液的体积、调节pH及咪唑浓度、增加一步纯化如离子交换疏水层析等。或对样品进行初步纯化如AS或PEI沉淀后再利用亲和层析完成纯化过程；
2.若洗脱组分中无目的蛋白或蛋白量过低，可通过Western Blotting方法对His标签蛋白表达和纯化样品进行定性和定量分析。如果蛋白表达量过低，则可尝试改变和优化表达条件来提高产量；如果蛋白表达量正常但是纯化效果不佳，则可尝试降低洗杂液浓度、提高洗脱液浓度以防止结合较弱或过强的目的蛋白的损失；
3.倘若上样过程中出现蛋白沉淀现象，则可能是操作温度太低，可以待样品恢复至室温后上样。也可考虑在样品或缓冲溶液中添加稳定剂。
zxb597
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破菌不完全不只是指菌体没有破开,还包括菌体虽然已经破开,但是核酸还不够破碎,即形成的核酸片段较大，洗涤之后的包涵体沉淀最好不要直接加8M尿素溶解，那样很容易在包涵体表面形成透明不溶物。
隔壁家的小夜猫子
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对的，用尿素裂破菌后的沉淀，直接可以结合亲和层析，亲和之后透析复性
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