重组蛋白表达的目的蛋白分子量小于预测的原因？

我觉得是蛋白质本身被降解了，还有是不是质粒构建的问题呢

第二次出现突变，很可能导致蛋白的一些性质发生变化，建议优化密码子，剔除突变进行确认。PS:预测和实际存在一定的偏差也正常。

蛋白本身被降解了，可以存在一些不利于该蛋白稳定的蛋白酶，在尽可能不影响目标蛋白结构的情况下，选择合适的标签，通过标签蛋白的高产量强启动表达带动目标蛋白的表达。

不知道是题主表达前后矛盾还是我理解有问题，前面说测序验证了没问题，后面又说测序结果有突变。如果存在突变那就重新构建质粒啊，虽然没有产生终止密码子，但你也说了氨基酸已经发生了变化，这可能导致翻译后修饰变化的。

建议做一下密码子优化，还有可能是因为三维结构之类的原因，可以尝试带chaperone表达质粒的感受态，或者更换成昆虫细胞等更高等的表达体系

预测大小和实际大小不一致有时是正常现象，蛋白质的形成过程中存在着修饰的过程，预测25kda，实际38kda，可能是蛋白质还没有被修饰。

我觉得可能是序列有问题，最好重新构建一个，测序后没有突变了再做纯化

原因估计是由于修饰或降解等原因，有可能与预测大小有偏差。

蛋白本身被降解了，可以存在一些不利于该蛋白稳定的蛋白酶，在尽可能不影响目标蛋白结构的情况下，选择合适的标签，通过标签蛋白的高产量强启动表达带动目标蛋白的表达。

可能在重组过程中，剪切时有误，受体中有影响分泌量的因素，蛋白质分子量的计算方法等。

如果验证构建质粒没有问题，目的蛋白跑胶小了10kD 首先，吧蛋白胶图的蛋白条带切胶去送质谱检测是否是你的目的蛋白，如果不是，重新用别的质粒进行构建克隆重新实验；如果是自己目的蛋白的一部分，可以分析得到的序列，检查是否自己基因序列表达的时候会在宿主细胞中断裂等等。。建议，更换载体，再次进行表达。检测看是否还会小10kd左右。

我不清楚你具体要表达的蛋白，但是有以下几个猜测: 1. 原目的蛋白存在多个亚基，突变后负责亚基间二硫键形成的残基缺失或移位，亚基无法连接导致电泳条带变小。 2. 目的蛋白高级结构过于复杂，电泳前或电泳步骤破坏了一些高级结构，使蛋白降解。

1.有没有这种可能性：你的目的蛋白质是多聚体？ 2.免疫印迹确认一下，再考虑换载体或者菌株。

酶切鉴定时目的条带一般都要淡于载体带，因为带的亮淡是和核苷酸的量有关的，核酸多掺入的EB量就大亮度就高，所以在摩尔数相同的情况下，分子量大的片段就会相应的亮一些。如果测序确定是正确的就是插进去了，和酶切条带的亮弱没有关系，因为你挑的是单克隆提取质粒，所以其中的菌的性质是一致的，即如果菌落PCR和酶切鉴定的结果表明含有重组质粒就每一个菌都含。诱导表达没有明显的表达带是很常见的，SDS-PAGE的分辨率是有限的，表达量小的时候是看不到明确的表达带的，需要用western进一步鉴定，如果是隐性结果才能说没有表达。改变诱导条件是有可能改变表达效果的，你可以从诱导温度、IPTG浓度、起始诱导菌浓度等几个方面进行改进。但也可能你的蛋白就是在这个表达体系中无法表达，需要更换表达载体或表达菌株；如果目的蛋白对细胞的毒性比较大的话，在大肠杆菌中无法表达，可以改用酵母或是哺乳动物细胞进行表达，可能效果比较好。

考虑一下目的蛋白存不存在切割，等电点是多少，是否确认该条带就是目的条带

兄弟，恭喜你，如果你用Ni柱纯化，这个25KD蛋白压根就不是你要的，这是大肠杆菌的一个分子伴侣,名字我忘记了。 给你简单教一下：pET32a 不知道你用的什么tag ，假设tag-A，快去买个抗体做一下WB，一目了然。 另外，针对你的纯化，看起来是没有表达，换个载体吧，MBP, GST，SUMO,Trx 都是不错的选择，另外查查蛋白Cys多不多。

质粒构建是否有问题？建议用高保真酶pcr，构建好后测序验证

氨基酸改变了可能引起蛋白结构稳定性的变化，你可以看看到突变位点前的氨基酸有多少个，分子量预测是多大

建议先把突变的载体重新该回来吧，确保没问题的情况下还是这么大小的蛋白，有两种可能要么是蛋白翻译后又发生了切割，要么是自我折叠后影响了蛋白的大小测定，所以说预测大小并不一定是准确的，实际大小才正常，这个很常见的