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27 个回答
红格子一号
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样本离心不彻底细胞碎片太多了导致堵了柱子
是小杨同学
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我觉得可能是杂质有点多然后柱子堵住了，或者是蛋白中杂带有点多哦
dxyhsx123
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个人认为应该是样本没有纯化好，杂质太多，柱子有点堵了。
z流沙z
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柱子填充过多，或者样品离心不够或者吸到沉淀导致大分子较多，或者样品浓度较高
lzy必有我师
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变性或非特异结合的蛋白占据了有效的结合位点，而通过洗脱液无法彻底清洗所致
医往情深丁香园
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离心不够实，有沉淀，蛋白浓度太高（增加lysis含量）；
dxy_bq4uxnd
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可能是超声破碎的不彻底，导致大分子的物质堵塞了整个柱子，建议超声功率与时间进行调整，充分离心，减少杂质后试试。
JCorona
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可能的原因：1.色谱柱堵塞；2.填料过多；3.样品粘稠
一支肾上腺素
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蛋白可能沉淀到柱子内部了，尝试降低上样量避免蛋白沉淀。
内科小护士
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可能原因，逐渐积累沉淀，变性或非特异结合的蛋白占据了有效的结合位点，而通过洗脱液无法彻底清洗所致
zxb597
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使用过程中发现堵塞严重，且流速越来越慢 样品粘稠度高。
dxy_h7vcp8v3
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其一，可能是因为蛋白上清离心不彻底，杂质太多。建议充分离心例如15000g 30_60min；也可以对上清液进行过滤然后过纯化柱 ；其二，可能是柱材重复使用，柱材里堆积杂质太多，建议柱材重生再次使用：其三，可能是承载柱材的垫片，被杂质堵住。建议，加柱材之前，在流水下冲洗几次，看到水流通畅后在加柱材进行后续实验。
ZZDX-YILILI
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1.有可能是柱子堵住了，建议用缓冲液多冲洗几次。
2.如果确定柱子没有问题，有可能是蛋白液体粘度太大，或者蛋白析出或者变性。
3.还有可能蛋白中杂带较多，目的蛋白含量小，使得杂蛋白过多结合柱子造成堵塞。
dxywode
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唑环结合而把蛋白结合下来的，这种结合里相对较弱，一般来讲，在过柱子的过程中有很多NI只与组氨酸标签中的一部分咪唑环结合，所以在这种情况下如果流速过快会阻碍他们进一步的结合，另外，流速过快大大缩短了NI与咪唑环结合的时间，减低了结合几率。
jey1235
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这个问题哦以前经常遇到，我总结一下几点：
1、上清务必要高速离心（18000g）30min以上，去掉沉淀
2、针对大肠杆菌表达，1L OD0.6菌最少50ml buffer重悬，昆虫可以少一些
3、有条件，上清加一些核酸酶，消化基因组。如果的柱子发黄就是这个原因
4、其次Ni柱最好5次使用以上务必再生而不是清洗，去掉所有粘附的蛋白
5、不建议加压力硬推，柱子用完要保存在20%EtOH
dxy_pni5ki46
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是重力柱吗，不知道样品上样前有没有离心过滤膜，样品是否粘度大，还有可能缓冲液不合适蛋白发生变性堵柱。重力柱本身也比用蠕动泵或者akta慢。
dxy_4uyyu09r
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首先是不是上次用完，，没洗干净啊？残留太多会影响到，其次上样量不能太多，可以稀释一下，少加。或者换新柱子，还有ph缓冲液都可以优化
Guoood
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首先用5倍柱子体积纯水清洗柱子，排尽空气。其次有可能是镍柱中有残余的蛋白，可考虑用盐酸胍或buffer处理一下应该会缓解；如果还是不太好用，可以再生镍柱。
bamboopiggy
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柱子是买的还是自己灌的？如果是买的，就是你的穿通液里面杂质太多，在上柱之前用0.45的滤器过滤。自己灌的柱子的话，看有没有气泡
dxy_f7vaev3r
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可能是柱用太久了，堵塞了，纯化慢，而且纯化出来的蛋白量少。
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