要送LC/MS液相色谱-质谱检测的co-IP胶条，操作全程注意事项？
丁香实验
细胞裂解的蛋白co-IP、SDS-PAGE凝胶电泳后，切胶条送LC/MS检测。请问从细胞裂解到送样，在样品制备全程种有哪些注意事项？
分享
17 个回答
一支肾上腺素
有帮助
注意安全，有些试剂毒性很大，特别是后面处理，每一步都要小心注意。
红格子一号
有帮助
一般处理就行，提取注意量一定要够进行烤染或者银染，方便回收
jey1235
有帮助
细胞裂解按照一般处理，胞浆蛋白可以温和处理，务必添加蛋白酶抑制剂。
电泳流程普通处理。全胶质谱的时候上层胶尽量做短一些。
切胶质谱可以关注目标条带位置尽量将其跑的分散一些。
切胶之前染色一下观察目标条带，确定具体位置，因为胶越窄后续越好操作。
染色之后无比保证脱色完全。除了蛋白条带被染色，空的位置尽量脱干净。
然后就是尽量切小，装ep管送去消化然后酶解等后续步骤。
ps.制胶的试剂稍微用点好的吧 或者买预制胶。确保胶没有杂质。
dxy_h7vcp8v3
有帮助
样品切胶的时候，要戴PE手套处理，避免手上沾有蛋白酶吧蛋白质降解，其次装蛋白条带的EP管采用进口处理的EP管（因为进口EP管相应杂质含量低，不会对实验结果造成很大影响）；最后蛋白条带切割下来，装进含有ddH2O的EP管，防止蛋白胶条变干。
ZZDX-YILILI
有帮助
1.样本裂解完之后放与低温条件4℃以下，防止样本降解。
2.最开始提取样本时尽量加入蛋白酶或者磷酸酶抑制剂，尽量使用新鲜样本。
dxy_bq4uxnd
有帮助
全程一定要规范操作，SDS- PAGE电泳时可稍微缩短一些时间，将蛋白集中于page胶的特定位置。还有co-ip注意冰上操作。
dxy_4uyyu09r
有帮助
总结起来就两个吧，一个不能降解了，一个不能污染了，特别是后面处理，每一步都要小心注意。另外也要注意安全。有些试剂毒性挺大的。
cathyxjjxjj
有帮助
每个条带尽量锐利使蛋白富集好切胶，蛋白量最少几微克，盐分尽量少，选择合适的酶进行酶解，脱盐尽量处理干净。
dxy_pni5ki46
有帮助
最主要是注意避免蛋白降解，coip下来的蛋白浓度可能比较低，电泳时注意样品上样量
飞天幻雪
有帮助
裂解正常操作就行，冰上或者4℃。加上蛋白酶抑制剂！切胶一定要记住位置，最好拍照。切胶的板一定不能有污染。用超纯水洗干净。ep管手套也都要用新的！收好样品及时放在冰上运输！
z流沙z
有帮助
首先细胞量要足够，自己wb和coip后再送样，建议至少要用6cm皿；注意需要的对照；然后蛋白冰上提取，正常操作
隔壁家的小夜猫子
有帮助
避免污染，更换新的跑胶液和染胶液。
Guoood
有帮助
需要保持切胶的胶条干净无杂蛋白污染。1.电泳完纯水清洗一次。2.换用干净手套，切胶所用刀片。3.切下胶条装入EP管中，再用纯水清洗一遍，4度保存即可。
verbalkint
有帮助
前期没有太多注意事项，就是正常裂解，正常做ip，然后跑胶的时候蛋白上样量大一些，这样考染比较容易看出来区别条带，然后切不一样的条带送去打质谱就行
bamboopiggy
有帮助
这个问题有点太大了，你按照protocol仔细每一步操作，先做一个预实验看看，如果能染出条带，就问题，不大，如果染不出条带，可能就需要调整1. coip用的抗体，2，收样的蛋白浓度，3，跑胶时候的buffer，4染胶的考马斯亮蓝 的浓度。
vae1476
有帮助
做过几次，需要注意的很多，捡几个重要的说一下：1.蛋白量要满足需要，需要提前预实验确定一下。2蛋白保证不要降解，尽快进行后续实验，不行的话一定要妥善保存。3注意复孔设置，样本单一不方便后续分析4预留同批次样本，以供后续验证或出现问题分析原因
dxy_w4oj7yoe
有帮助
IP全程保持低温，选择合适的IP-buffer，不要wash体积太大，以免将很多互作蛋白洗下来。跑胶不用跑很久，大概跑到胶孔以下0.5-1 cm处就可以切条带送质谱了
相关产品推荐
相关问答
提问
扫一扫
实验小助手
扫码领资料
反馈
TOP
打开小程序