原核表达在包涵体里，该这么提蛋白做纯化呢？

偶然回头

2013-01-25

我目前在做的蛋白表达，这个蛋白没有加其他tag ，只是添加了个his 标签。原核表达在包涵体里面，真核表达在沉淀部分，后面我想测定蛋白的酶活，所以得把这个蛋白纯化出来，现在这种情况应该怎么做纯化呢？ps：该蛋白在末端有个糖基化修饰的位点，通过GPI锚定到细胞膜上，我的蛋白不溶和这个有关系吗？

1 个回答

丕龙兄

2013-10-21

有帮助

1.蛋白在包涵体里很常见，原因也很多，你可以尝试一下其他的解决方案。比如说降低诱导温度，更换表达载体（GST标签有增溶作用，pCOLD低温表达载体…），更换表达菌株； 2.如果上述尝试还是不成功，那就只能变性纯化了，用变性剂（如6-8M尿素）溶解包含体，然后过镍柱，这样可以得到大量蛋白，纯化出的蛋白通过透析进行复性，然后测酶活。 3.复性的蛋白酶活跟所用的复性缓冲液有很大关系，查文章，用他们的实验方法做，然后逐渐改进，多试几种不同的复性缓冲液。 Ps：包涵体形成的原因很多，比如一级结构中两端有很多输水氨基酸啦什么的。不明白“通过GPI锚定到细胞膜”啥意思~~~