关于RNase R和放线菌素D有没有必要做？

你好，我也想做circ，最后你在验证成环方面做了哪些实验？只有qpcr吗？

在验证cirRNA的时候,RNase R处理与聚乙烯醇沉淀确实是常用的方法,但进行这两项实验可能需要一定的成本,以下是一些建议:

1. 如果仅为了验证cirRNA的环型结构,设计环内和环外引物进行PCR验证也是可以的。确保引物跨断环结点。

2. 可以只做RNase R处理实验,因为其可以降解线性RNA而不影响环型RNA,可以验证cirRNA的环形性质。

3. 不一定需要聚乙烯醇沉淀实验,该实验主要是提供cirRNA存在于细胞质而不是细胞核的证据。如果定位不是研究重点可以省略。

4. 建议做Northern blot实验,以完整band证实cirRNA的存在,该方法成本较低。

5. 如果条件允许,测序或RACE实验可以确定cirRNA的结构,但成本也较高。

6. 综合各种验证结果,即可证实cirRNA的存在。如果资源有限,可以只做RNase R处理和PCR验证。

有必要，实验步骤

1.RNA 提取：

①样品处理：组织样品准备，细胞样品准备 ②RNA 提取

③总 RNA 定量

④circRNA 的预处理：去除核糖体 RNA 和 poly-A RNA

2.RNAase R 酶消化

（RNase R 是一类核糖核酸外切酶，能降解大部分线性 RNA，但 circRNA 不易被 RNase R酶消化降解。因此可以通过该实验鉴别 circRNA 和线性 RNA。）

①准备总 RNA 样品

②RNase R 反应体系

3.放线菌素 D 实验

（circRNA 半衰期一般比线性 RNA 长、稳定性更好。放线菌素 D 能抑制 RNA 的转录，可以利用放线菌素Ｄ处理细胞，检测细胞中 circRNA 和同源线性基因的含量，可反映circRNA 和线性 RNA 的半衰期和稳定性。）

4.证明成环实验：

①circRNA 高通量测序

②Northern Blot：制备尿素-丙烯酰胺变性胶；探针制备；杂交实验

• ③发散引物 RT-PCR

设计好引物需要做一个pcr.放线菌素没有条件可以不做

RNaseR和放线菌素D有条件可以做一下，没有的话设计好引物做PCR检测就可以了