关于荧光定量PCR的Ct值的

主要考虑以下几点原因：

(1)反应的循环数不够：一般要在35个循环以上，但是过多的循环次数可增加背景值。

(2)检测荧光信号的步骤有误：SYB-Rgreen法（SG法）采用的是72延伸时采集荧光信号，Taman法则是在退火结束或延伸结束时进行信号采集。

(3)引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性，若是电泳条带呈弥散状，可考虑重新合成引物或探针。

(4)模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。

(5)模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

(6)序列或者引物有误：检测样品中不含有待检测基因。

有没有扩增曲线，如果有扩增曲线就没有问题，阈值重新设定。

qPCR阴性对照是用于检测qPCR实验中是否存在污染或假阳性结果的样品。在一些情况下，可能会观察到阴性对照中出现Ct值，这可能是由于低水平的非特异性荧光信号或者低水平的污染所致。

相比之下，内参基因是被用来规范样品中模板DNA数量的基因。内参基因的Ct值应该要比阴性对照的Ct值低很多，因为内参基因应该在每个样品中都存在，且数量相对稳定。如果内参基因的Ct值也很高，那么可能意味着反应出现了问题，比如试剂不足或是PCR条件不正确等等。

需要注意的是，即使内参基因在不同样品中Ct值不同，只要在同一组实验中，内参基因的Ct值与其他基因的表达变化趋势是一致的，那么仍然可以用内参基因作为规范基因来计算相对表达量。