插入序列与egfp之间序列有很多碱基会引起突变吗

可能会，最好是将中间序列去掉，仅保留少量碱基，

序列过长首先是不好构建，其次是引物不好设计，再者会增加失败几率

将插入基因与EGFP融合表达的蛋白构建到质粒中，同时还有2000bp的碱基序列，这样的序列长度通常不会引起突变。但是，在构建蛋白时，需要考虑到引物设计、序列克隆和筛选等问题。

引物设计

在设计引物时，需要将插入基因与EGFP融合的序列分为两部分，分别克隆到两个不同的引物上。其中，插入基因序列的引物应该选择在序列的两端设计有带有限制性内切酶切位点的引物。EGFP序列的引物则应该选择在序列的两端设计与插入基因引物相匹配的引物。在引物的设计过程中，需要注意避免引物中出现多个相同碱基重复序列，以免PCR扩增时发生错误扩增或产生突变。

序列克隆

在序列克隆时，可以选择使用标准的PCR扩增和限制性内切酶消化克隆方法，也可以使用现代化的无切割克隆技术，如基于反向遗传学的接头PCR克隆方法（Gibson Assembly）等。不同的克隆方法都有各自的优缺点，具体选择需要根据实际情况进行考虑。

筛选

在筛选克隆时，可以选择测序或限制性酶切分析等方法。测序可以直接确定插入基因与EGFP融合的序列是否正确，限制性酶切分析则可以判断克隆是否正确，但无法确定序列是否存在突变。因此，建议在测序和限制性酶切分析两个方面进行筛选，以确保所得的克隆序列的正确性和稳定性。

总之，在构建插入基因与EGFP融合表达的蛋白的过程中，需要注意引物设计、序列克隆和筛选等方面的问题，以确保所得的克隆序列的正确性和稳定性。