丁香实验_LOGO
登录
提问
我要登录
|免费注册

一个疑问:熔解曲线有 2 个或 2 个以上的峰如何解决

相关实验:实时荧光定量 PCR(realtime PCR)

user-title

dxy_vg0qqx08

具体的表现原因如下:反应特异性差, 有引物二聚体 或其他非特异 性扩增!还有ΔRn 不超过 1,在低水平徘徊,会出现无扩增等情况,请问,如何解决?

=

wx-share
分享

7 个回答

user-title

此用户已注销

有帮助

是不是引物二聚体,你做个阴性对照(只加引物,不加模板)就知道了。不过看峰的位置,是非特异的扩增,与你的引物或者cDNA有关,你已经试过了多种退火温度都没有改善,说明它影响不大。

user-title

曙光karry

有帮助

1采用两步法,适当提高退火温度

2引物10uM,20ul的体系加0.5ul

3模板梯度稀释的时候不要1+9ul这样稀释,扩大体积比如20+180ul

user-title

清澈的微风

有帮助

较为理想的熔解曲线是单峰曲线,如出现多峰有以下原因:


1)非特异性扩增:主要原因为引物特异性不好、Tm值较低或模板质量不高,可以根据设计原则设计新引物或者通过梯度 PCR 对引物退火温度(Tm值)进行优化,上调Tm值,选购质量较好的离心柱法核酸提取试剂,提高核酸提取质量,等等。


2)引物二聚体 可通过琼脂糖凝胶电泳确认引物二聚体。引物二聚体在凝胶的底部形成扩散条带,通常位于100 bp以下。引物二聚体在熔解曲线内峰值一般位于75℃左右,如该峰显著请按照以下方面进行优化:


A.优化扩增条件,如提高退火温度,可利用梯度PCR,摸索最佳的Tm值。通常两步循环(由 95℃变性步骤直接进入 60℃退火和延伸步骤) 有利于强效扩增,因此引物设计时设定的成功退火温度为 60℃。


B.引物浓度太高,适当降低引物浓度。通常引物的Tm低于目的基因,熔解曲线上峰值在目的基因峰的左边。大多数情况下,每条引物的理想最终浓度为200 nM,但如有需要,可将浓度降至60nM。


C.cDNA模板带有基因组DNA污染:重新制备cDNA模板。在RNA提取完成后加入DNase对RNA进行处理,然后逆转录为cDNA。


如果排除以上原因还是出现熔解曲线多峰的情况,就要考虑及时更换试剂盒,避免耽误实验进度

user-title

土井挞克树

有帮助

可以考虑重新设置基线,然后排除一下体系降解。

user-title

bamboopiggy

有帮助

溶解曲线如果不是单一峰的话,最好重新设计引物

user-title

whilt-shirt

有帮助

重新设计新的引物吧,这个不能用了

user-title

天一湖医者

有帮助

有可能是引物特异性不好,或者是你的目的片段有多拷贝/同源序列。

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
扫码领资料
反馈
TOP
打开小程序