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具体的表现原因如下:反应特异性差, 有引物二聚体 或其他非特异 性扩增!还有ΔRn 不超过 1,在低水平徘徊,会出现无扩增等情况,请问,如何解决?
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是不是引物二聚体,你做个阴性对照(只加引物,不加模板)就知道了。不过看峰的位置,是非特异的扩增,与你的引物或者cDNA有关,你已经试过了多种退火温度都没有改善,说明它影响不大。
曙光karry
1采用两步法,适当提高退火温度
2引物10uM,20ul的体系加0.5ul
3模板梯度稀释的时候不要1+9ul这样稀释,扩大体积比如20+180ul
清澈的微风
较为理想的熔解曲线是单峰曲线,如出现多峰有以下原因:
1)非特异性扩增:主要原因为引物特异性不好、Tm值较低或模板质量不高,可以根据设计原则设计新引物或者通过梯度 PCR 对引物退火温度(Tm值)进行优化,上调Tm值,选购质量较好的离心柱法核酸提取试剂,提高核酸提取质量,等等。
2)引物二聚体 可通过琼脂糖凝胶电泳确认引物二聚体。引物二聚体在凝胶的底部形成扩散条带,通常位于100 bp以下。引物二聚体在熔解曲线内峰值一般位于75℃左右,如该峰显著请按照以下方面进行优化:
A.优化扩增条件,如提高退火温度,可利用梯度PCR,摸索最佳的Tm值。通常两步循环(由 95℃变性步骤直接进入 60℃退火和延伸步骤) 有利于强效扩增,因此引物设计时设定的成功退火温度为 60℃。
B.引物浓度太高,适当降低引物浓度。通常引物的Tm低于目的基因,熔解曲线上峰值在目的基因峰的左边。大多数情况下,每条引物的理想最终浓度为200 nM,但如有需要,可将浓度降至60nM。
C.cDNA模板带有基因组DNA污染:重新制备cDNA模板。在RNA提取完成后加入DNase对RNA进行处理,然后逆转录为cDNA。
如果排除以上原因还是出现熔解曲线多峰的情况,就要考虑及时更换试剂盒,避免耽误实验进度
毛利小五郎的徒弟
可以考虑重新设置基线,然后排除一下体系降解。
bamboopiggy
溶解曲线如果不是单一峰的话,最好重新设计引物
whilt-shirt
重新设计新的引物吧,这个不能用了
天一湖医者
有可能是引物特异性不好,或者是你的目的片段有多拷贝/同源序列。
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