关于剪接体引物设计

在两种剪接体的共有序列上设计引物就可以

分普通引物 和 qPCR引物设计

普通PCR引物：目的是获得目的基因，对非特异性反应 和 引物二聚体 要求不严格

RT-PCR 引物：目的是让目的基因按照理论值扩增，对扩增效率、特异性及引物二聚体要求严格。

可以借鉴《qPCR引物设计》这篇文章讲的非常详细。

一、PCR引物设计原则

1、引物长度一般在15-30bp

引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；

2、引物GC含量一般为40%-60%

引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；

3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右

Tm值在72℃左右可使复性条件最佳，至少要在55-80℃之间。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)；

4、引物3’端的碱基一般不用A

引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。

5、引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。