怎么确定很好的荧光定量PCR的引物，具体看哪些参数进行区分呢？

引物最好位于编码区5’端的300-400bp,无二级结构（自由能小于58.61KJ/mol），长度一般在17-25碱基之间，G+C含量45-55％，TM58-62

引物与靶序列间的Tm值不应该过低，引物长度在15-30个碱基之间

1.引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过 70%或有连续 8 个互补碱基同源。 2.避开产物的二级结构区，选择扩增片段时最好避 开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计 mRNA 的稳定二级结构，有助于选择模 板。 3.长度 寡核苷酸引物长度为 15~30bp，一般为 20~27mer。 4.G+C 含量 G+C 含量一般为 40%~60%。其 Tm 值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50% 寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于 Tm 值 5~10℃。若按公式 Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的 Tm 值，则有效引物的 Tm 为 55~80℃，其 Tm 值最好接近 72℃以使复 性条件最佳。 5.碱基随机分布 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其 3′端不应超过 3 个连续的 G 或 C，因这样会使引物在 G+C 富集序列区错误引发。 6.引物自身 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级 结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。7.引物之间 两引物之间不应有互补性，尤应避免 3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引 物间不应多于 4 个连续碱基的同源性或互补性。 8.引物的 3′端 引物的延伸是从 3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构 可能，除在特殊的 PCR（AS-PCR）反应中，引物 3′端不能发生错配。 9.引物的 5′端 引物的 5′端限定着 PCR 产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而 不影响扩增的特异性。引物 5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+ 等；引入蛋白质结合 DNA 序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列 等。 10.密码子的简并 如扩增编码区域，引物 3′端不要终止于密码子的第 3 位，因密码子的第 3 位易发生简 并，会影响扩增特异性与效率。