QIAGEN质粒大提

QIAGEN并是专门用于去内毒素的。但是QIAGEN也有专门的去内毒素质粒提取试剂盒。

1.从新鲜的划线选择平板中挑取一个单克隆菌落，接种到2-5m1含相应的选择抗生素的LB培养基上，37°C强烈振摇培育8h。所用试管或烧瓶的容量至少是培养基容量的4倍。

2.稀释起始培养物的1/1000到1/500，接种到选择性LB培养基。对于高拷贝质粒，接种25m1或100mm1培养基;对于低拷贝质粒，接种100m1或500m1培美基。37C强烈振摇培育12-16h。烧瓶或试管的容量至少是培养基容量的4倍。培养物的细胞浓度大约为3 - 4x10^9个细胞/毫升，对应的沉淀物净重约为3克/升培养基。

3.通过4C6000xg离心15min收集细菌。打开离心管，倒净上清液，直至所有培养基流净如果想暂时中止操作，应将沉淀冻存于 -20°C。

4.使用4ml或10m1 Buffer P1重悬细菌沉淀。为有效打散细菌，使用足够大的容纳溶解缓冲液混合物的试管是必要的。确保Buffer P1中加入了RNA酶A。细菌应通过上下吹打充分重悬直至无细胞团块。

5.加入4ml或10m1 Buffer P2，轻轻颠倒混匀4- 6次，室温5min。不要吹打，因为这样会导致基因组DNA断裂。溶解产物应该显得粘稠。不要让溶解反应超过5min。使用后装Buffer P2的瓶子应立即盖上，以免被空气中的CO2酸化。

6.加入4ml或10m1预冷的Buffer P3，立即轻轻颠倒4 - 6次混匀，冰上培育15 min或20min。使用冷冻的Buffer P3并冰上培育可增强沉淀作用。加入Buffer P3后，出现白色絮状沉淀，溶解产物变得不再粘稠。沉淀物包括基因组DNA、蛋白质、细胞碎片和SDS。溶解产物应充分混匀，以确保十二烷基硫酸钾沉淀。如果混合物仍然粘稠，呈褐色，则需充分混匀以完全中和溶液。

7.在4C>20000xg离心30min，迅速转移含质粒DNA的上清液。

这个QIAGEN是去内毒素的试剂盒

QIAGEN Plasmid Maxi Kit并不是专门用于去内毒素的。如果需要去除内毒素，可能需要采用专门的内毒素移除试剂盒。不过，QIAGEN确实也有提供专门的去内毒素质粒提取试剂盒，如EndoFree Plasmid Kits。

QIAGEN Plasmid Midi and Maxi Kits 的试剂盒操作步骤是这样的：

1. 从新鲜的划线选择平板中挑取一个单克隆菌落，接种到2-5ml含相应的选择抗生素的LB培养基上，37℃强烈振摇培育8h。所用试管或烧瓶的容量至少是培养基容量的4倍。

2. 稀释起始培养物的1/1000到1/500，接种到选择性LB培养基。对于高拷贝质粒，接种25ml或100ml培养基；对于低拷贝质粒，接种100ml或500ml培养基。37℃强烈振摇培育12-16h。烧瓶或试管的容量至少是培养基容量的4倍。培养物的细胞浓度大约为3－4×10^9个细胞/毫升，对应的沉淀物净重约为3克/升培养基。

3. 通过4℃6000×g离心15min收集细菌。打开离心管，倒净上清液，直至所有培养基流净。如果想暂时中止操作，应将沉淀冻存于－20℃。

4. 使用4ml或10ml Buffer P1重悬细菌沉淀。为有效打散细菌，使用足够大的容纳溶解缓冲液混合物的试管是必要的。确保Buffer P1中加入了RNA酶A。细菌应通过上下吹打充分重悬，直至无细胞团块。

5. 加入4ml或10ml Buffer P2，轻轻颠倒混匀4－6次，室温5min。不要吹打，因为这样会导致基因组DNA断裂。溶解产物应该显得粘稠。不要让溶解反应超过5min。使用后装Buffer P2的瓶子应立即盖上，以免被空气中的CO2酸化。

6. 加入4ml或10ml 预冷的Buffer P3，立即轻轻颠倒4－6次混匀，冰上培育15 min或20min。使用冷冻的Buffer P3并冰上培育可增强沉淀作用。加入Buffer P3后，出现白色絮状沉淀，溶解产物变得不再粘稠。沉淀物包括基因组DNA、蛋白质、细胞碎片和SDS。溶解产物应充分混匀，以确保十二烷基硫酸钾沉淀。如果混合物仍然粘稠，呈褐色，则需充分混匀以完全中和溶液。

7. 在4℃≥20000×g离心30min，迅速转移含质粒DNA的上清液。