求各位大神，带带！本人刚接触蛋白实验，需要做EMSA与footprinting，希望大家推荐。谢谢

凝胶迁移实验是一种研究DNA与蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的常用技术，这项技术是基于DNA 蛋白质或RNA 蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳中有不同迁移率的原理。本实验是将提取到的蛋白粗提液，与生物素标记的DNA一同保温，在非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA复合物比非结合的探针移动得慢。EMSA中结合滞后条带的有无，以及量的多少可反映出DNA结合蛋白与DNA探针的结合活性，DNA结合蛋白的表达及活化水平。 实验前准备

在实验开始前，先准备好本次实验所需的各种试剂盒和相关常规试剂，所需的试剂盒包括：核蛋白提取试剂盒，EMSA检测试剂盒等，需从冰箱里拿出室温解冻或冰上解冻待用。

本次实验所需的耗材和仪器有：赛默飞公司提供的的Thermo Scientific全波长扫描式多功能读数仪、QSP盒装吸头及Nunc冰盒，芬兰百得的各个量程单通道移液器，离心机，恒温水浴锅摇床等。

下面进入实验部分，首先介绍本实验基本操作流程为，先进行核蛋白的提取以及定量，探针标记，随后进行凝胶的配置及预电泳，根据得到的核蛋白与探针，进行样品的制备，

上样进行电泳，经过电泳分离后，转移到尼龙膜上，最后进行显色。

核蛋白提取

本步骤是参照NE-PER Nuclear and cytoplasmic Extraction Reagents展开的实验。首先将现用现配的Buffer A和Buffer C配置好，Buffer A是1ml CER I加入10μl蛋白酶抑制剂，Buffer C是1ml ER Buffer加入10μl蛋白酶抑制剂.配置好，混匀后放置于冰盒中。

取数量约为5×10^6-10^7/ml的待用细胞，用预冷PBS洗涤两遍，尽可能除去上清，勿留残液，估计离心后的压积细胞体积，每10μl体积，加入100μl的Buffer A，混匀后涡旋剧烈振荡，冰上放置10-15min。

加入11μl冷CER II Buffer，混匀后剧烈振荡5s，放置冰上1min，再次振荡5s后，4℃，16000×g离心5min，尽快将上清转入另一预冷的洁净微量离心管，置于冰上，即得胞浆蛋白。在离心沉淀物中加入100μl预冷的Buffer C，最大转速涡旋剧烈振荡15s，放置冰上40min，每间隔10min涡旋剧烈振荡15s；4℃，16000×g离心10min，尽快将上清转入一预冷的洁净微量离心管，即得核蛋白。

最好去找你同实验室的师兄师姐，问问他们是怎么做的。这两个的protocol都可以去搜索引擎搜，甚至丁香通里都有。

emsa 的protocol可以直接去搜索引擎搜索。

footprinting：

• Clone a piece of DNA that contains the operator site to which the repressor binds.
• Label one end of the DNA molecules with a radioactive molecule, e.g. radioactive ATP .
• Digest the DNA with DNase I .
  • DNase I cuts DNA molecules randomly (in contrast to restriction enzymes that cut where they find a particular sequence)
  • Choose such gentle conditions that most molecules will be cut only once.
• The result will be a mixture of radioactive fragments of varying length, with the smallest increment in length represented by a single nucleotide.
• Separate the fragments by electrophoresis .
• Binding of the lac repressor to the sequence of 24 base pairs in the operator prevents DNase I from attacking that region of the molecule.
• When the fragments are separated by electrophoresis, those representing the lengths covered by the repressor will be missing from the autoradiogram.
• The resulting gap is the "footprint".
• The same sample of DNA (unprotected by the repressor) is subjected to normal DNA sequencing and the resulting ladder aligned with the footprint autoradiogram.

EMSA实验操作步骤

形成蛋白-探针复合物

（1）在0.5ml离心管中按顺序将下列组份混匀：

蛋白样本（2-5μg） Xμl

poly d(I-C) 1μl

Binding Buffer 2μl

Nuclease-Free ddH2O Xμl

总体积 9μl

（2）冰浴5min后，加入1μ探针。（对照组加1ul对照探针）

（3）PCR仪中室温（20-23℃）温育30min。

制备凝胶，电泳

（1）制备6.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶：（注意根据试剂情况按比例调整总体积）

5XTBE 1ml

30%Acrylamide/Bis 2.2ml

deionized,sterilewater 6.62ml

80%Glycerol 80μl

10%AP 90μl

TEMED 10μl

总体积 10ml

（2）按标准步骤制备凝胶。

（3）加样前先在预冷的0.5X TBE buffer中120V预电泳10min，与电泳完毕后冲洗加样孔。

（4）混合样本及电泳缓冲液，点样电泳。

（5）将电泳槽置于冰上或者4℃环境中，恒压100V进行电泳，直至缓冲液指示带距离凝胶底部2~3cm为止。（大约50-60min，根据实际情况调整电泳时间及电压；电泳时间不宜过长）

转膜

（1）在预冷的0.5XTBE中浸泡凝胶，膜，滤纸和纤维垫。

（2）按如下顺序组装“三明治”：纤维垫，滤纸，凝胶，膜，滤纸，纤维垫。注意电极，确保凝胶位于阴极、膜位于阳极。

（3）在预冷的0.5XTBE中进行转膜。转膜装置应置于冰上或者低温室中，恒压60V转膜1h。（注意根据实际情况调整电压及时间）。

检测

（1）去除转好的膜，放入合适的盛有缓冲液的容器中，冲洗。（注意整个检测过程避免膜干燥）

（2）去掉冲洗缓冲液，加入封闭液后轻微震荡，室温封闭20min。

（3）加入适量的HRP酶标记的链霉亲和素（Streptavidin-HRP conjugate），室温震荡孵育45min。（勿将酶标记物直接加到膜上）

（4）去掉酶联物稀释液，用洗涤缓冲液洗膜三次，每次室温轻微震荡1 0min。

（5）配置反应底物，均匀加至膜上，室温孵育5min。（可以在加完底物后，用薄膜轻轻覆盖在膜上，是底物均匀覆盖，注意不要产生气泡）

（6）化学发光成像系统曝光成像（曝光时间的长短可以根据检测方法不同而进行相应调整）。