凝胶迁移实验（EMSA）

实验分类：

DNA 实验

最新修订时间：2023-06-02

简介

凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）可以：（1）研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用；（2）可用于DNA定性和定量分析；（3）用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

来源：丁香实验

操作方法

凝胶迁移

一、探针的标记 1. 如下设置探针标记的反应体系：（1）待标记探针 (1.75 pmol/微升) ：2微升。（2）T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) ：1微升。（3）Nuclease-Free Water ：5微升。（4）[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) ：1微升。（5）T4

做 EMSA 时一直发现堵孔的情况，怎么解决？

1、改变胶浓度，一般 5-6%；2、提高探针浓度：10 nM - 0.5 μM 范围内改变试试；3、适当减少上样量；4、更换探针，上述 3 点都尝试了不行的话可能是探针上没有结合位点，所以蛋白不下去，此时可以看到探针下去了，而蛋白没有下去，这需要更换探针才能解决。

EMSA 看不到迁移带是什么原因？如何解决？

1、蛋白降解或者蛋白在细胞系中表达低。对策：用蛋白跑一次 WB 可排除，若是这种情况，则需要更换样品或者加大样品量。2、探针上没有与蛋白结合的位点。对策：更换探针可解决。3、转膜效率低或者成像时间过短。对策：改善转膜条件，一般在 0.5X TBE 中恒压 60 V 转膜 1 h，最好放在冰上；成像时间也须从短时间逐渐延长，直至能看到成像。4、抗体级别不行。对策：更换 EMSA 级别的抗体可解决。5