我用高保真酶扩三个基因，用55度退火只有第一个有条带，然后用62度退火有两个扩出来了，但是出现了特异条带，最后一个一直P不来。

GC含量较高，可以尝试使用GC buffer,或者加入DMSO。另外你的正反向引物Tm 值差的有点大的话可以尝试touchdown PCR ，或者尝试做一下梯度，摸索一下最适Tm。

其原因如下：

１） PCR模板中往含有 PCR 反应的阻碍物，模板量越大 反应的阻碍物，模板量越大 PCR 就越难扩增。

２） PCR 反应模板量和引物过多，会造成非特异性扩增严重，结果也会导致目的片段扩增不出来。

建议：换一种高效率的Taq酶试一下；检查引物有没有错，RNA在反转前一定要电泳验证，用DNA模板试一下；可以用基因组扩增一下是否有产物，大小是否正确，这样就能确定引物是否有问题了；cDNA反转后测一下浓度检测一下含量，跑个电泳检测一下质量，根据浓度计算具体需要多大体积的cDNA了

先看你的酶的说明书，根据引物的tm值，确定你的annealing temperature 到底该是多少，不能这么猜