分子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程（基因技术，基因重组）是目前分子生物学研究热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因调控和表达的方法，也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。转化（transformation）、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。基因重组的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化，得以增量，便于分析。 外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化（transformation），以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染（transfection）。利用载体（噬菌体或病毒）把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导（transduction）。一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位（tr

一、 酸杂交技术 检验方法建立的基本要素是特异性和灵敏度，在复杂的物体中，使无法感觉的特定物质进入人类的观察范围。核酸杂交检测技术就是利用核酸碱基严格配对的特异性，核酸标记物的灵敏度而建立的检测核酸结构与功能的方法。该法建立以来已有二十年，目前研究实验室用得多，临床实验室用得较少，除成本高外，关键是操作复杂，重复性差，仅能半定量。成本高可随经济发展而缓和，但其它缺点尚需努力克服。 杂交实验的探针应具有特异性，对应不同的杂交方法靶基因（被检基因）应有一定的纯度与丰度。杂交反应的开始是碰撞，探针浓度高则速率增加，一般32P标记探记探针5-100ng/ml，非放射性探针25-1000ng/ml，原位杂交无论放射还是非放射物标记，一般都需0.1-5.0μg/ml。当探针过量时，杂交速率取决于探针长度，如一个100ng/ml20个核苷酸的合成寡核苷酸探针与1-100pg 1kb长的靶基因杂交，10分钟能达到最大杂交率。而相同条件下2kb的克隆探针需160小时。主要原因是这里所指浓度是重量浓度而非摩尔浓度。长探针因标记量大，小的摩尔浓度已

从化学和生物学的意义上理解，探针是一种已知特异性的分子，它带有合适的标记物供反应后检测。探针和靶的相互反应如抗原 - 抗体、血凝素 - 碳水化合物、亲合素 - 生物素、受体和配体，以及核酸与其互补核酸间的杂交等反应均属此类。用核酸探针与待检标本中核酸杂交，形成杂交体，再用呈色反应显示。此方法用于疾病的诊断，称为分子杂交基因诊断。此法开始用于遗传性疾病的诊断如血红蛋白病的诊断、先天性遗传病的产前诊断。近来，已发展为诊断外源性病原体如病毒、细菌、原虫等的方法；内源性病变基因研究如癌基因检测、基因突变、基因缺失或变异引起的疾病的基因诊断；人类基因识别及其生理功能和衰老有关研究；在法医检测中有关性别鉴别和 DNA 指纹谱的鉴定。基因探针的研究引起了人们高度重视，在探针的制备技术上有重大突破。可将核酸分子探针检测比喻为在柴草堆中去找一根针的神奇技术。据美国华尔街分析家预言： “ 在生物技术市场中，下一个突破和具有吸引力的是基因探针 ” 。它的巨大的开发潜力和经济效益，已引起人们的重视。 目前基因检测方法中以同位素标记（ 32P 、 35S 等） DNA 探针

一、实验目的 观察分析植物细胞有丝分裂中期染色体的长短、臂比和随体等形态特征，学习染色体组型分析的方法。了解和掌握不同物种染色体组型和带型分析的方法和技术，进一步鉴别染色体结构和染色体组。要求至少利用一种方法制备出一个物种的合格的染色体标本，进行组型分析或进行不同的带型，如G-带、C-带等分析。练习显微摄影的操作过程，拍摄和印放显微照片。 二、实验条件 本实验在遗传学实验室完成。遗传学实验室提供： 1、实验仪器及用具 显微镜（附摄影装置），冰箱，恒温水浴锅，电子天平，容量瓶，试剂瓶烧杯，染色缸，载玻片，盖玻片，剪刀，镊子，玻璃板，滤纸，标签，铅笔 2、药品和试剂 冰醋酸，无水酒精，甲醇，盐酸，柠檬酸钠，氢氧化钡，氯化钠，磷酸二氢钠，磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，甘油，Giemsa粉剂，果胶酶，纤维素酶 试剂1：Giemsa液：0.5克Giemsa，33ml甘油，33ml甲醇，用少量甘油将Giemsa粉末研磨至无颗粒，剩余甘油分次洗涤至棕色瓶内，置56℃恒温2h，加入甲醇，过滤后保存于棕色瓶中。 试剂2 ：5％氢氧化钡：5gBa(OH)2加入100ml沸蒸馏水中溶解后过滤

一、样品的浓缩 　　生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的： 1、减压加温蒸发浓缩 　　通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。 2、空气流动蒸发浓缩 空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。 3、冰冻法 生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。 4、吸收法 通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化

在某些情况（例如用寡核苷酸作Southern印迹杂交的探针）下，重要的是要将寡核苷酸标记至尽可能高的放射性比活度。磷酸化反应最多能使每一寡核苷酸分子中掺入一个32P原子。但用大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段3合成与合成寡核苷酸互补的DNA链， 则可得到比活度更高探针（Studencki 和Wallace，1984;Ullrich等，1984b）。用一短引物与寡核苷酸模板结合，后者的序列互补于所用的放射性标记探针。 该引物后在大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段的作用下延伸，从而使[γ－32 P]dNTP在模板指导下发生掺入。反应后，通过对模板和产物进行变性继而通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳交将它们分开。用这种方法，有可能生成这样一种寡核苷酸探针，即每一寡核苷酸分子带有若干个放射性原子。其放射性比活度可高达2x1010 计数/（分．mg）。对该法进行改进后，可以由两段3'端含互补序列的寡核苷酸合成更长的探针（Ullrich等，1984a）。 在准备进行这些类型的反应时，务必考虑以下几点： （1） 反应中[α-32P]dNTP的比活度 α－磷酸已完全被32 P置换的

　电泳完毕后，可立即将乙醛酰RNA自琼脂糖凝胶转移至硝酸纤维素滤膜，有以下几种转移方法：毛细管洗脱法、真空转移法和电印迹法。毛细管洗脱法如下所述， 真空转移法和印迹法则按有关仪器生产厂家产品说明书进行。尽管有人认为在转移前对琼脂糖凝胶进行预处理实属不必（Thomas，1980）甚至有害（Thomas，1983）， 但我们认为含甲醛的凝胶必须用经DEPC处理的水淋洗数次，除去甲醛。 如果琼脂糖中浓度大于1％或凝胶厚度大于0.5cm或待分析的RNA大于2.5kb，需用0.05mol/L氢氧化纳浸泡凝胶20分钟。 然后在凝胶上放置硝酸纤维素凝膜或尼龙膜，RNA随向上迁移的缓冲液转移至固相支持体（硝酸纤维素滤膜或尼龙膜）上。 1）将凝胶移至一个玻璃皿内，用锋利刀片修凝胶的无用部分，在凝胶左上角（加样孔一端为上）切去一角，以作为下列操作过程中凝胶方位的标记。 2）用长和宽均大于凝胶的一块Plexiglas有机玻璃或一叠玻璃板作为平台，将其放入大千烤皿内，上面放一张Whatman 3MM滤纸，倒入20xSSC使液面略低于平台表面，当平上方的3MM滤纸温透后，用玻棒赶出

合成的寡核苷酸在合成时其5'端缺少一个磷酸基， 因而极易用T4 噬菌体多核苷酸化反应，这种探针可达到于 γ＝ 32 P从[ γ＝ 32 P]ATP本身同样高的放射比活度。下面所述的反应是为对10pmol寡核苷酸进行高比活度的标记而设计的。通过扩大或缩小这一反应的规模便可成功地标记不同量的寡核苷酸，而各成分的浓度则可保持不变。 1） 配制下列反应混合液： 寡核苷酸（10pmol/ μl） 1.0 μl 10xT 4 噬菌体多核苷酸酶缓冲液 2.0 μl [ γ＝ 32 P]ATP(比活度5000Ci/mmol;10mCi/ml水溶液)(10pmol) 5.0 μl水 11.4 μl 10xT4噬菌体多核苷酸激酶缓冲液 0.5mol/L Tris.Cl(pH7.6) 0.1mol/L MgCl2 50mol/L 二硫苏糖醇(DTT) 1mol/L 盐酸亚清胺 1mol/L EDTA(pH8.0)充分混匀，在一装有10 μl 10mol/L Tris.Cl(pH8.0)的反应管内加入0.5 μl上述反应混合液，搁置一旁留备步骤3）中使用。该反应所含[ γ

１．带有非互补突出端的片段 　　用两种不同的限制酶进行消化可以产生带有非互补突出端的片段，刀就是最容蜴 克隆的片段。常用的大多数质粒载体均带有由几个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点。由于现有的多克隆位点如此多样，因而几乎总是能找到一种带有与外ＤＮＡ片段未匹配的限制切位点的载体。于是，采用所谓的定向克隆即可将外源ＤＮＡ片段插入到载体当中。例如：载体pUC19用BamHl和Hind－Ⅲ进行消化，然后，通过凝胶电泳或大小排阻凝胶层析纯化载体大片段，以使同芤下来的多克隆位点 缺小片段分开。于是，这一载体就可以同有与BamHl和ＨindⅢ所切出未端相匹配的粘端的外源ＤＮＡ区段相连接。用得到的环状重级体化大肠杆菌，检查氨苄青霉素抗性。由于HindⅢ和BomHI的突出端不互补，载体片段不能有效地环化，所以转化大肠杆菌的效率也极低。因此，大多数具有氨苄表霉素抗性的细菌都含有带外源ＤＮＡ区段的质业，外源ＤＮＡ区段成为连接HindⅢ和BamHI位点的桥梁。当然，可以根据特定的外源ＤＮＡ区段来改变限制酶的组合方式。 　　如要制备定向克隆载体，它尽量避免使用大多克隆位点上彼此直接相邻的限制

　如今，质粒载体中限制酶切位点的种类极为繁多，因而通常都有可能找到某种带限制酶切位点恰恰与外源ＤＮＡ片段本身毫无二致的载体。这就具备一个不可比拟的优点，也应是可以用相应的限制酶消化重组质粒崦回收外源ＤＮＡ。另一种方案，则是把片段插入到载体中能产生匹配末端的任何位点中。例如，识别不同的六核苷酸的限制酶BamHl和BglⅡ产生具有相同突出末端的限制酶切片段，这样用BglⅡ消化而制备的外源ＤＮＡ片段可以克隆到用BanHl消化的质粒中。这通常会使接合序列不能被曾用于外源ＤＮＡ或制备载体的任何一种酶所切开。然而很多清况下，用切点位于多克隆序列侧翼的限制酶进行消化，可将片段从重组质粒中摘出。偶尔在质粒的以及外源ＤＮＡ两端的限制酶切位点之间，不可能找到“门当户对”的搭配关系。这时可用下面两种方案加以解决： １）在线状质粒末端和（或）外源ＤＮＡ片段的末端接上合成在接头或衔接头。 ２）在得到控制的反应条件下，用大肠杆菌ＤＮＡ聚合酶I Ｋlenow片段部分补平带3'凹端的ＤＮＡ片段。如第九章所讨论，这样常可以使那些不相匹配的限制酶切位点转变为互补末端，从而促进载体和外源ＤＮＡ的连接。因为部分补平反

当ＲＮＡ自琼糖凝胶转移至硝酸纤维素滤膜之前，溴化乙锭的染色时间一般不宜过长，这是因为被染料饱和的核酸分子，其转移效率有所降低。然而，用溴化乙锭作短暂染色，既不至于对核酸转移过程产生可以察觉的掏作用，又独具同时检测凝胶和凝膜上的ＲＮＡ的优点。 １．方法Ｉ １）电泳结束后，含乙二醛－ＤＭＳＯ的凝胶应浸入含溴化乙锭（0.5 μg/ml）的10mmol/L磷酸钠（pH7.0）溶液。甲醛凝胶需用无ＲＮＡ酶的水淋洗，用20xＳＳＣ溶液浸泡，随后用含溴化乙锭（0.5μg/ml）的20xＳＳＣ溶液染色。 ２）于室温染色５－１０分钟，在紫外灯下观察，照像。 ３）按前所述方法， 将凝胶中的ＲＮＡ转移至硝酸纤维素滤膜，转移后能常在学光下也可看出已染色的ＲＮＡ条带。 这种方法仅适用于每一泳道均含有相当大量（如５μg 以上）的ＲＮＡ的情况。 ２．方法Ⅱ 　　硝酸纤维素滤膜上的ＲＮＡ也可以用下述方法染色：从干烤后的硝酸纤维素滤膜上剪下所需的条带进行染色，也可以用经过杂交并经Ｘ光片曝光后的整张滤膜进行染色（Ａ.Ｅfstratiadis,未了表材料）。 １）

1 、目的基因的获取： （ 1 ）特定细胞表达的目的基因：提取 RNA 后进行反转录， PCR 扩增； （ 2 ）载体中含有的目的基因：酶切或 PCR 获取； （ 3 ）融合蛋白基因：根据需求，进行 PCR 合成目的基因； 2 、穿梭质粒的构建： （ 1 ）携带目的基因的穿梭质粒的构建：通过酶切、连接的方式得到，一般采用的是 pShuttle-cmv 载体； （ 2 ）携带多个目的基因的穿梭质粒的构建：如同时表达两个目的基因，可通过 IRES 将两个目的基因相连； （ 3 ）携带干涉序列 shRNA 的穿梭质粒：首先将 H1 启动子构建到 pShuttle 质粒上，然后将目的基因克隆到 H1 启动子下游； 3 、重组腺病毒质粒构建： 携带目的基因的穿梭质粒线性化后与 Adeasy-1 共转 BJ5183 感受态细胞（电转），筛选得到重组腺病毒质粒，并经 PacI 酶切鉴定：可见目的质粒出现两条条带，分别为 3.0kb 或 4.5kb 和 >23Kb 两条条带。 将得到的重组腺病毒质粒转染 DH5 a 感受态细胞，以便于

SUPER Green Ⅰ（10,000× DMSO溶液，电泳级） SUPER Green Ⅰ核酸染料特点 ● 无毒性：属花箐类染料，容易生物降解，无致癌毒性。 ● 灵敏度高：至少可检出20pg DNA，高于EB染色法25～100倍。 ● 信噪比高：样品荧光信号强，背景信号低。 ● 操作简单：无须脱色或冲洗，即可直接用紫外凝胶透射仪或可见光透射仪观察。 ● 适用范围广：可适用于多种凝胶电泳方法：琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳、脉 冲电场凝胶电泳和毛细管电泳等。 ● 使用方便：对分子生物学中常用的酶（如：Taq 酶、反转录酶、内切酶、T4连接酶 等）没有抑制作用。 ● 经济：价格比银染便宜。 SUPER Green Ⅰ使用方法简介 1．胶染法（用法同EB） （推荐方法，见图1） （1） 制胶时加入SUPER Green I 核酸染料。冷却胶至50℃左右，每100mL胶中加入3～5μL SUPER Green I 核酸染料。 （2） 按照常规方法进行电泳即可。 u

（1）原理 腺病毒（adenovirus，AV）是一种没有包膜的线状双链DNA，它能感染分裂细胞和非分裂细胞，在核内以神经元细胞的形式复制，存在多种AV血清型。到目前为止，构建的绝大多数载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方法取代E1或E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在表达高水平E1和E3基因的细胞中复制，因此适合应用于治疗的高效控制系统。腺病毒载体能够高效传递和表达基因的能力（尤其是在体外），由于具有宿主范围广，对人致病性低；在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因；能有效进行增殖，滴度高；与人类基因同源；不整合到染色体中，无插入致突变性。对于难转染的细胞，如原代或非分裂细胞，采用病毒递送miRNA/shRNA的方式是非常有效的选择。 （2）服务流程 1）构建表达miRNA/shRNA的腺病毒载体，采用PacI消化纯化质粒使ITRs裸露出来。 2）将腺病毒表达克隆转染293A细胞。收获细胞以制备病毒粗提液。 3）将病毒粗提液感染293A细胞以扩增病毒。确定病毒滴度。 4）将病毒上清加入靶细胞中 5）分析miRNA/shRNA的表达和相应的Knockdonw结

美国MicroFab公司，成立于1984年，一直致力于喷墨打印技术在工业领域的应用和发展。至今MicroFab的产品和技术已经涉及到非常广泛的生产和科研领域。每个领域都会有专业的应用工程师提供建议和解决方案，从制造业到研究机构，MicroFab都能为您提供精确微量点滴的产品和技术方案。包括有：  铅与无铅焊料的粘合剂；  光学和电子聚合物；  蛋白质及DNA等生物医学的药物使用等。 MicroFab的Jetlab系列设备是专为实验室研究微量点滴、微量喷射以及微流体所设计的。它为喷墨打印技术在工业以及科研领域的应用提供了一种可观察和优化的工具。包括：  软件控制运动平台XY方向定位；Z轴控制打印头高度；  Print-on-the-Fly两轴同步打印或点对点打印；栅格与矢量打印模式，可以进行复杂程序的打印；  CCD相机用于液滴观测或衬底观测；  底板固定，气动隔振；光工作区；架空HEPA过滤器；溶剂排出口；  气压和温度控制；  JetDrive III双极和任意波形模式、单一和突发模式驱动电子单元。 Microfab最新推出了Jetlab®4系列以满足广大客户对

第二章 酵母双杂交筛选 1. 操作流程 诱饵基因转化筛库宿主菌Y190――>含诱饵基因的Y190 保种――>诱饵基因的 自激活检测――>筛库(组织库或者小文库)――>挑选鉴定阳性克隆――>抽提阳 性克隆中PREY 质粒并在细菌中扩增――>猎物(Prey)质粒与诱饵(Bait)质粒共 同转化Y190，验证其相互作用 2. 方 法 2. 1 诱饵基因转化筛库宿主菌Y190 1） 3 个1mm 克隆接种于3mlYPD 液体培养基30℃振荡培养20 小时(过夜)， OD600 达到1.2 左右。 2） 将此3ml 菌液接入大体积(体积视转化个数定)YPD 中培养4 小时左右，使 培养液OD600 达到0.6。 3） 50ml 离心管收集菌液(Falcon, BD)，Eppendorf Centrifuge 5810R, 700g (1， 865rpm)，5 分钟离心收集菌体，弃上清。 4） 20ml ddH2O 重悬菌体，Eppendorf Centrifuge 5810R，700g，5 分钟离心收 集菌体，弃上清。 5）

美国科学家发现一种用处极大的细菌 　美国马萨诸塞州大学科学家 2003 年 12 月 17 日宣布，他们发现一种存在于泥土中的细菌能够帮助清理含放射性元素的废料，而且还可能用来发电，制成生物电池。 　科研人员发表在《科学》杂志上的文章说，这种具有异常功能的细菌名为减硫性土壤类细菌。通过破译与分析细菌的基因组，研究人员发现，这种细菌内的基因可使它们将很多不同的金属和放射性元素从地下水中沉淀出来，并将放射性元素转化成便于分离的固体。这些放射性元素包括铀、锝和铬等。科学家认为，该细菌这一功能可以用来清除核废料与清洁环境，防止上述放射性元素流入水井或河流污染饮用水源和自然环境。与此同时，美国能源部的科学家说，这种细菌还可以控制金属的电子运动，因此可作为生物电池的构成部分，用来发展生物能源。 　科研人员初步解释了这种细菌功能的作用机理。他们认为，这种细菌内有约 100 个基因，似乎可以产生某种类型的蛋白质，协助把金属中的电子“移来移去”，

染色体结构显示和检测 1） 染色体显带 显 Q 带法 1. 漂洗：取经过干热预处理或已老化的染色体标本，置于 pH6.0 缓冲液中浸 5~10 分钟。 2. 染色：浸入 pH6.0 的 GM 或 QD 染液中 5~10 分钟。 3. 漂洗：浸入新鲜 pH6.0 缓冲液中漂洗两次，每次 5 分钟。 4. 观察：向标本染色体面滴 1~2 滴新鲜缓冲液，覆以盖片（避免出气泡），置荧光显微镜下观察。 显 G 带法 胰酶 -Giemsa 混合显带法 1． 预处理：取中期染色体标本，置 60 ℃～ 60 ℃温箱中 20 ～ 30 分钟，或在 37 ℃温箱过夜，然后浸入 0.025M 磷酸缓冲液中， pH6.8 ， 56 ℃温浴 10 分钟。 2． 消化和染色：用现配制的胰蛋白酶 -Giemsa 混合液消化和染色 10 ～ 30 分钟，混合液按如下比例配制： 0.025 M 磷酸缓冲

DNA （基因）检测－ Southern Blot DNA 吸印转移 1． 室温下将电泳后的琼脂糖凝胶浸入 500ml 溶液 A 中，摇动 30 分钟后换 500ml 新鲜溶液 A 再摇 30 分钟，使 DNA 双链碱变性。 溶液 A ： 5M NaCl 300.0ml 10M NaOH 50.0ml H2 O 650.0ml 2 ．为使凝胶重新回到中性，换入溶液 B 中重复上述 1 过程。 溶液 B ： 10M 乙酸铵 200.0ml 10M NaOH 4.0ml H2 O 1796.1ml 硝酸纤维素薄膜（ NC 膜） 3 ．料盒或盘中放一玻璃板支架，倒入 10 × SSC ，将 Whatman 3MM 滤纸放在玻璃板上，两头浸在液体中，用玻棒赶除气泡。 4．

蛋白质检测－ Western Blot 1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 1） 转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用 5ml 移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。 2） 在凝胶 / 滤膜外再包一张 3mm 滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。 3） 将此滤纸 / 凝胶 / 薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。 4） 将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 5） 按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 6） 转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。 2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。 3. 用 100ml 水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。 4. 膜置印迹缓冲液中于 37 ℃保温 1 小时。 5. 室温下，用 PBS-Tween 缓冲液洗涤薄膜。 6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽