高手来了啊 欢迎 多谢 帮忙看下我的这3条引物， 想选2 条。将用的是3‘RACE法 扩未知序列用的PRIMER 5 刚入门， 希望得到大家的帮助 给点意见 哪2条好呢？还是有什么缺陷， 要另设计？谢先了啊我的引物5' GTGAGAAGTTCCGTTATGC 3' seq no 67 ,length 19, Tm 50 ,GC%47.45' CGAGGAGGGAGAGGAAGAATAAACG 3' seq no 209,length 25, Tm 66 ,GC%525' CACGAACCACCAAAAAAACCCAACC 3' seq no 241 ,leng ...
基因序列如下：1 ctcctg gtgcaatgga gcgagtatta aaggtctttc attattttga aagcaatagtgagccaacca ccgaccactgtg agcccgcggc gtgaggcgtg ggaggaagcg cggctgctgtcgcccagcgc61 cgccccgtcg tcgtctgcct tcgcttcacg gcgccgagcc gcggtccgaa gtcttgctgt121 gtcacccagg ctgccagg ...
小妹从文献上找了一对引物，各种条件几乎都摸了，都出现二聚体，P不出来，请各路大哥指点迷津，引物是否可用。引物序列如下上游序列：5’-TGA CCC ACT TGC CAC CCG TGC-3’ 下游序列：5’-GCA GCA CCC CAG GGC TGG C-3’酶切位点为825，,PCR产物268bp。基因序列为 1 ccacaatagg ggcagacctg tccatccttc tctgtgggtc ccctgtacct ttctccccca61 acaggatcag acccagaggc agc ...
怎样选出最合适的Taq酶随着分子生物学研究发展的不断广泛和深入，PCR已成为一门相当成熟的常规技术，而热聚合酶（即Taq酶）的合理选择是PCR成败与否的一个关键因素。目前市面上有多种Taq酶，能够满足多方面的实验需要。那么，如何选择最合适的Taq酶？根据用户经常考虑的指标，如特异性、保真性、耐热性、扩增速率、扩增片段长度、能否进行复杂模板扩增以及优化条件难易等等，我们在这儿将主要的Taq酶归归类，其性质、用途也就一 ...
——从RNA提取到荧光定量PCR完美解决方案从RNA开始到基因定量PCR的研究，已经开始成为一条经典的实验流程，其在科研、临检、进出口检验、公安系统等多种领域的应用越来越广泛。不过由于RNA提取以及荧光定量PCR实验的灵敏度和特异性要求，使得这一实验方案在实验操作、实验设计以及实验数据分析方面，对于实验人员的要求越来越高。TIANGEN公司根据多年在这一领域的研发经验，给客户提供一套规范的“从RNA提取—RT— ...
以下是我在网上查到的有关RT-PCR的资料,同丁香园的战友共享,希望对这方面实验的战友有所帮助!RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。2. RT按要求做，一般不会出太大问题。3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。1）RT和PCR时的引物设 ...
厦门大学第三届“荧光PCR－基础与应用”研习班通知（2008年11月30日—12月6日，厦门）实时荧光PCR以特异性强、灵敏度高、定量准确、全封闭等优点，已成为基础生物学研究的重要平台技术，正成为临床诊断新一代标准技术，广泛应用于传染病、遗传病、肿瘤等领域。为使广大一线工作人员全面掌握该技术，同时熟悉该领域的最新进展，厦门大学分子诊断实验室在2004、2006年成功举办两届研习班并获得广泛好评的基础上，再次携手国外实 ...
迷北方的狼 战友整理了5月上旬的0应助帖，我仔细看了一下，有很多都是因为提供的信息不够多，或者，可以在精华区轻松搜索得到答案的帖子。我将5月下旬的帖子整理一下，热心战友请积极应助:P整理过程中发现，不规范帖的0求助绝大多数是不规范帖。不知道本次整理会不会助长不规范帖的增长，希望不是！为了您的问题得到快捷和有效的解答，为了版面的整洁，请按规范发帖！另外，声明几点：1 留qq号而且标题也不规范的帖子没有整理。2 标题简单的写”求助 ...
1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。2.引物长度一般在15~30碱基之间。引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。3.引物GC含量 ...
PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污 染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生.一、污染原因 (一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于 密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提 取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶 或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染. (二)PCR试剂的污染:主要是由于在P ...
最近在做一批细胞，打算要做PCR，因此引物设计这关逃不过了。beta 2 (TGFB2)、TGF A、VEGFC、VEGI各位同仁，我通过向两个老师请教设计了两套引物，方法如下。待各位同仁哪一种方法比较好。引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。设计原则：引物与模板的序列要紧密互补。引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。引 ...
PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时 ...
从外周血提取DNA是一个经常遇到的问题，当然可以用试剂盒提取，不过代价还是有点大，并且不方便，定试剂总要等上几天，如果血液标本不稀缺资源，不妨用一些简便方法提取。方法一(1)取抗凝血5ml在沉淀中加入15ml PBS，混匀，离心2000r/min10min。(2)将血浆转至新的试管中，-70℃保存。(3)将血细胞转入另一支试管中(10ml或50ml)加入尽可能多的冷的蒸馏水混匀。(4)将其插入冰内5～10min或放入-20℃15 ...
基因表达的检测有几种方法。经典的方法（仍然重要）是根据在细胞或生物体中 所观察到的生物化学或表型的变化来决定某一特定基因是否表达。随着大分子分离技 术的进步使得特异的基因产物或蛋白分子的识别和分离成为可能。随着重组DNA技术 的运用，现在有可能检测．分析任何基因的转录产物。目前有好几种方法广泛应用于 于研究特定RNA分子。这些方法包括原位杂交．NORTHERN凝胶分析．打点或印迹打 点．S－1核酸酶分析和RNA酶保护研究。这里描述 ...
在进行荧光定量PCR实验中，Ct数值非常重要，因为通过对标准物质进行定量PCR实验绘制出标准曲线，进而利用标准曲线法求出未知样本中的起始拷贝数。目前定量PCR仪器采用的是最大二阶导数法和样点拟合法计算Ct数值，其原因为实际工作曲线并没有相应的函数所能准确对应，因而采取以上两种方法。这里我举例说明一下使用样点拟合法计算Ct数值并进一步求算出起始拷贝数的过程。y = 4.416x - 80.128 当y=1.64 时 x=18.52y = 2.368x - ...
需准备的材料及试剂：1、DEPC水处理的EP管（1.5ml，1.0ml），Tip头2、玻璃平皿、镊子180℃烘烤6小时，以祛除RNA酶3、硝酸纤维素膜4、DigRNA labeling kit（sp6/T7）5、经分离纯化的线形模板DNA6、DEPC水处理过的无RNase 的0.2M EDTA，PH=8.07、RNA稀释用Buffer8、BufferⅠ9、BufferⅡ10、50×blocking11、Detection12、Dig 抗体及显色底物 ...
真郁闷啊，一个目的基因扩增了3个月也没出来，换了好几个引物，都是文献上的，结果不是产物bp数不对，就是目的条带超暗还有非特。一咬牙，决定赶鸭子上架自己设计一把，结果用primer premier 5.0设计出来的引物，一个90分以上的都没有，也没有错配、发夹等全“NONE”的结果出现，拿分值最高的去OLIGO验证，实在很不理想。当然我知道不可全信软件，但是总得找个让自己信服的根据吧。唉，老板天天对我叹气，说你什么时候能给我个 ...
我用primer premier设计的引物,但是好像有错配.1ctctccaaga agactcagcc agacccactc cagctccgac cctaggagac cgacctcctc61 cagacggcag cagccccagc ccagtggaca accccaggag ccaccacctg gagcgtccgg121 acaccaacct ccgccccgag accgagtcca ggctccggcc gcgcccctcg tcgcctctgc181 ac ...
我刚接触引物设计，希望大家热心帮忙。我从ncbi中找到一些微卫星序列，用pp5.0设计引物，好像根据引物设计原则，都找不到好的引物。不知道是不是在参数的设计上有什么规定，还是有什么窍门。请高手指教。提供几段序列，请高手作为例子帮忙讲解一下如何设计引物扩增重复序列。1 ggtggtggtg ctgtgagtta tacaagaccc agtaggaagc agcggcaggc agtattattt61 cagtggtttg agccaaaact ...
我做的是人巨细胞病毒gB基因，序列如下ccgcggccgtctcgggtgtcttcagggagccgcaccgaccttggctgccaagtccgtatccctcctcctcgactgcgggtgtttcccggagggtccgcgcgacacgcaagagaccacgacgcgcctcatcgctgctggatttggcccgcgacgaacatggaatccaggatctggtgcctgg ...
