RNA探针标记Protocol

需准备的材料及试剂：1、DEPC水处理的EP管（1.5ml，1.0ml），Tip头
2、玻璃平皿、镊子180℃烘烤6小时，以祛除RNA酶
3、硝酸纤维素膜
4、DigRNA labeling kit（sp6/T7）
5、经分离纯化的线形模板DNA
6、DEPC水处理过的无RNase 的0.2M EDTA，PH=8.0
7、RNA稀释用Buffer
8、BufferⅠ
9、BufferⅡ
10、50×blocking
11、Detection
12、Dig 抗体及显色底物（NBT/BCIP）

RNA探针的标记反应
1、取1μg纯化模板DNA，加入无菌、无RNase的EP管中，以DEPC水补齐体积至6.5μl
2、在冰上加入下述试剂
10×NTP labelig mixture 7 1μl
10×Transcription buffer 8 1μl
Rnase inhibator 10 0.5μl
RNA polymerase SP6 11 1μl
or
RNA polymerase T7 12 1μl
轻轻混匀，短暂离心
37℃孵育2小时——过夜
3、向上述反应体系中加入2μlDnase(Rnase free)以祛除模板DNA
37℃孵育2小时
4、2μl 0.2M EDTA终止反应

探针浓度的检测
1、稀释：分别以RNA稀释用Buffer稀释RNA探针及controlRNA labeled
探针倍比稀释 1：10 1：100 1：500 1：1000 1：5000 1：10000
control RNA labeled 倍比稀释
1：10 1：100 1：500 1：1000 1：5000 1：10000 1：100000 1：1000000
2、点膜：T7、SP6方向探针及control 各点一排
剪掉膜的一角以做标记
按照浓度由低到高依次点膜
3、紫外交连，2min
4、BufferⅠwash ,2min
Buffer Ⅱ wash ,15min
5、抗体反应：1）包被：1×blocking,30min (blocking以BufferⅠ稀释）
2）加抗体反应，30min，37℃（抗体浓度1：5000，以1×blocking稀释）
6、BufferⅡ wash,5min×2
7、Detection,2min
8、呈色，暗处过夜：显色剂NBT/BCIP：Detection = 1:50
9、显色后用水冲洗干净，干燥后扫描保留结果
显色后一定要先用水冲洗以终止反应，在做扫描，否则光线照射将增高背底。