RNA探针杂交步骤以及效价测定

RNA 原位杂交中的探针

（一）探针的种类

RNA 探针是指带有标记的能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链 cDNA 或 cRNA 分子。 根据在 RNA 杂交中所使用的探针依其来源可分为三种： 即特异性 cDNA、 cRNA 探针和人工合成寡核苷酸探针。

1. 单链 cDNA 探针： 由于 cDNA 中不存在内含子及其它高度重复序列，又克服了双链 cDNA 探针在杂交反应中 两条链之间复性的缺点，从而提高了杂交反应的敏感性。但由于单链 cDNA 探针的制备比 较困难，在 RNA 原位杂交中已很少见有应用。

2. cRNA 探针： 是以 cDNA 为模板，通过体外转录而获得的。因为它是一种单链探针，因此也避免了应用 双链 cDNA 探针做杂交反应时存在的两条链之间的复性问题。cRNA 与 RNA 之间形成的杂 交体要比 cDNA-RNA 杂交体稳定。

cRNA-RNA 之间形成的杂交体不受 RNA 酶的影响。因 此杂交反应后可用 RNA 酶处理， 以除去未结合的探针。 由于 cRNA 探针具有以上这些优点， cRNA 探针的杂交饱和水平又比双链 DNA 探针高出 8 倍， 因此在原位杂交中应用广泛。 cRNA 探针的缺点是：探针的制备过程比较复杂，需要较好的分子生物学实验设备，它对 RNA 酶 敏，易受破坏，操作中要谨防 RNA 酶污染。

3. 寡核苷酸探针： 人工合成的寡核苷探针是以核苷酸为原料，通过 DNA 合成仪合成，避免了真核细胞中存在 的高度重复序列带来的不利影响。由于大多数寡核苷酸序列较短，不需要纯化，组织穿透性 极好。 根椐目的基因的特异性序列设计的探针， 特异性较强。

合成的寡核苷酸探针的缺点是： 探针长度必须适宜，探针太长可造成内部错误配对杂交，探针太短可形成非特异性结合。它 与 mRNA 形成的杂交体不如 cRNA-RNA 杂交体稳定，再则探针较短，所携带的标记物少， 敏感性较低。 依标记物不同，探针又可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。

前者主要包括 3H、35C、32P 和 125I 等，不同的同位素探针其穿透力、定位和半衰期各不相同，无一种同 位素探针具有穿透力强、定位好和半衰期长所有优点。

由于半衰斯短、性能不稳定、污染环 境和危害健康等原因，在 RNA 原位杂交中应用同位素标记探针已日趋减少，而非同位素标 记探针在近年来得到迅速发展，其标记物主要有生物素、地高辛、酶和荧光标记等。

其中地 高辛标记的 cDNA、RNA 和寡核苷酸探针，不但具有生物素标记优点，还克服了生物素标 记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干扰等缺点，其应用越来越广泛。

（二）探针的标记

在 RNA 原位杂交中，不仅要选择适当的探针，而且还要使探针得到有效的标记。探针标记 法有酶反应法和化学反应法。

1. 酶反应法： 用于 RNA 探针的酶反应法主要为末端标记法与体外转录法。末端标记法是将标记物导入线 型 DNA 或 RNA 的 5'端或 3'端的一种标记法，末端标记适用于合成寡核苷酸探针的标记， 用末端标记制备的探针一般携带的标记分子较少。

2. 体外转录法： 体外转录法是一种制备与片段序列相同的单链 RNA 探针的方法。 进行体外转录时，先将靶核苷酸序列转入到含噬菌体转录启动子的载体中，然后在 RNA 聚 合酶的作用下，以 DNA 为模板，以含有标记的三磷酸苷为原料，对启动子下游的序列进行 转录，而启动子本身并不被转录。

体外转录常用噬菌体转录启动子，如沙门氏菌噬菌体和大肠杆菌噬菌体 T3、T7。当两个不 同的噬菌体转录启动子结合在载体多位点的两侧， 用适当的限制性内切酶在插入序列的下游 将质粒线性化。

SP6 噬菌体的 RNA 聚合酶对 SP6 启动子序列具有高度的亲和性，从而启动 下游的转录，在 4 种三磷酸核糖核苷和相应的噬菌体 RNA 聚合酶存在的条件下，即转录成 RNA。如反应物中含有标记的三磷酸核糖苷核，所有的 RNA 就被标记。 依标记物为同位素和非同位素， 近年来非同位素标记探针已有了极大的进步。 常用非同位素 标记技术有生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶和荧光素。

非同位素标记法又可分为直接标记法和间接标记法。 直接标记法是将标记物直接结合到探针上， 当探针与组织内相应靶核苷酸结合后， 即可显色 观察。这类标记探针必须符合标记物在杂交过程中不丢失，又不影响杂交反应为条件。

大量已发表的文献表明，由于检出杂交信号受到多种因素抑制，只能限于靶 RNA 丰富的细胞或 组织中，RNA 杂交对低拷贝的基因检测不理想。近年来间接标记法得到较快发展，先将标 记物结合在探针上，通过特异性识别，由特异性结合多种酶，对检测的杂交信号作用放大， 这一类标记法已展示极好的发展前景。

（三）探针的纯化

某些标记探针必须经纯化后方可使用。 这是因为在探针标记过程中， 反应液中仍存在一些未 被结合到探针中去的剩余 dNTP 等小分子。为将掺入并结合到 cDNA、cRNA 和标记寡核苷 酸与游离的标记寡核苷酸分开，常使用乙醇沉淀法或酚/氯仿抽提法进行纯化。

乙醇沉淀法的原理是：DNA 可被乙醇沉淀，而未掺入 DNA 的 dNTP 则保留在上清液中，由 此反复乙醇沉淀能将两者分开。

核酸溶液中去除蛋白质的酚/氯仿抽提法的原理是：交替使用酚、氯仿这两种不同的蛋白质 变性剂，以增加去除蛋白质杂质的效果。因为酚虽能有效地变性蛋白质，但不能完全抑制 RNA 酶的活性，而且酚能溶解 10~15% 的水，从而溶解一部分 ploy（A）RNA。

为克服这两方面的局限，混合使用酚与氯仿，对于 RNA 提取显得更加重要，氯仿还能加速有机相与液相分层，去除植物色素和蔗糖。

（四）杂交前准备

1. 载玻片和盖玻片的处理 为有效防止外源性 RNA 酶的污染，杂交用的载玻片和盖玻片可按以下步骤处理。

将载玻片和盖玻片分别浸泡在 5% 洁消精中 12 小时，用 35℃~40℃ 温水中冲洗 30min，再用双蒸水漂洗 3 次，每次 5min，室温下干燥切片后，在 180℃ 烤箱内烘烤 4~6 小时，盖玻 片可按近期内所需量，用铝箔纸包裹后烘烤后存放。 为防止组织或细胞标本在杂交过程中漂起或脱落， 载玻片应涂以粘附剂， 大的冰冻或石蜡切 片建议用明胶粘附剂，活检或较小的标本建议用多聚左旋赖氨酸或硅烷粘附剂。

2. 明胶涂片制备 取 10 克明胶溶于 1000 毫升 40℃~50℃ 双蒸水中， 待明胶完全溶解后加入 4 毫升 25% 硫酸 铬钾溶液（chromium potassium sulfate CPS） ，使 CPS 的终浓度为 0.1%。将烘烤后的载玻片 浸泡在明胶溶液中 10min， 在室温下干燥玻片。

再将载玻片浸泡在含有 1% 多聚甲醛， pH7.4 的 PBS 溶液中 10min;在室温下干燥玻片后再将载玻片浸泡在含有 1% 多聚甲醛，pH7.4 的 PBS 中 10min，在室温下干燥玻片。60℃ 烤箱内过夜备用。

3. 多聚左旋赖氨酸涂片的制备 取 2~4mg 多聚左旋赖氨酸，分子量在 300000 以上，溶于 1ml 消毒去离子水中。经旋涡器反 复搅拌，吸取 20~30μl 滴加到玻片一侧，再取另一张载玻片复合，将赖氨酸溶液均匀涂抹在 裱组织切片处，并将涂有粘附剂的一面用铅笔标出，室温下干燥切片后，在 60℃烤箱内过 夜备用。

4. 硅烷涂片的制备 取 5 毫升氨基丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane APES）溶于 250ml 丙酮内。将 烘烤后的载玻片浸泡硅烷溶液中 60min，用双蒸水漂洗 2 次，每次 10min 干燥玻片后，60℃ 烤箱内过夜备用。

注意事项： 载玻片的粘附剂及涂片制备，以组织切片或细胞不脱落、不干扰杂交信号、低背景、经济及 制备方便为原则，在制备过程中，需戴一次性手套及口罩，防止手指皮肤上的 RNA 酶的污 染。多聚左旋赖氨酸溶液的浓度可按实际应用效果调整，并应注意有效期限，制备载玻片应 尽快使用，防止赖氨酸解聚而失效。

5. 新鲜标本的储存和冰冻切片制备 为 RNA 原位杂交作新鲜标本储存和冰冻切片过程中，应严防 RNA 酶的污染，制备过程中 所使用的容器、刀具等均经高压消毒或清洁后用 0.1% 焦碳酸二乙酯（Diethyl pyrocarbonate DEPC）水清洗。

为防止 RNA 迅速降解，标本离体后，先切成 1.5× 1.2cm 大小，其厚度不超过 0.2cm，应迅 速投入 4% 多聚甲醛溶液内， 4℃冰箱内 2~4 小时。 置 再将组织移入 30% 蔗糖 PBS 溶液内， 4℃ 冰箱内过夜。次日可将标本储存于-80℃ 或-140℃ 超低温冰箱内保存。

如作冰冻切片，先将组织在-20℃恒冷切片机内停留，待温度回升后，然后在恒冷冰冻切片 机内切成 7μm 薄片。 40℃ 烤箱内干燥切片 2 小时后储存在-80℃ 或-140℃ 超低温冰箱内备 用。

6.标本的固定和石蜡切片的制备 石蜡切片作 RNA 原位杂交的，也应严防 RNA 酶的污染，容器、刀具等去除 RNA 酶的过程 同冰冻切片。

为防止 RNA 迅速降解，离体后标本应立即有效固定。

为保存良好组织结构， 有利探针的穿透力，应选用合适的固定剂。 常用的化学固定剂可分为沉淀固定剂和交联固定剂两类。前者有乙醇、甲醇和丙酮等，后者 有多聚甲醛、甲醛和戊二醛等。经沉淀固定剂固定的组织通透性较好，利于探针穿入，但过 长时间固定可引起 RNA 降解。

其不足之处是：组织形态结构的保持不如交联固定剂。交联 固定剂能较好保存组织中 RNA 和组织形态结构，但固定时间过长，也可发生胞浆和胞核内 大分子化合物形成交联，影响探针的穿透力，阻碍杂交体的形成。

4%多聚甲醛固定液 取 4g 多聚甲醛和 0.25g 甘氨酸分别溶于 100ml 0.01mol/L pH7.0 PBS 溶液，组织在常温下浸 泡于 4% 多聚甲醛中 4 小时，每 1 小时将组织在真空下吸干 10min，再注入新的固定液，共 4 次。

然后用 0.01mol/L pH7.0 的 PBS 漂洗 2 次，每次 30min。

福尔马林醋酸固定液 福尔马林醋酸固定液由 50% 酒精、10% 福尔马林和 5% 醋酸组成。在常温下将组织浸泡 4 小时，每 1 小时在真空下吸干 10 分钟，再注入新的固定液，共 4 次，然后用 50% 酒精漂 洗 2 次，每次 30min。

（五）杂交前探针的选择

1. RNA 探针： RNA 探针的长度以 50~150 碱基为佳，探针易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。长 500 个 碱基的探针杂交时间约需 20 个小时左右，如超过 500 个碱基的 RNA 探针则在杂交前用有 限碱基水解法控制其长度。

（1）孵育时间 t=Lf- Lo/ K × Lo× （Lo=核酸探针原长度（kb），Lf=核酸探针水解后所需长度 Lf （kb），K 是常数率=0.11kb/min）。

（2）在室温中加入下列终止水解：3mol/L 醋酸钠，6.6μl（终浓度 0.1mol/L），醋酸 1.3μl（终浓度 为 0.5%）。

（3）加入下列沉淀探针： 7mol/L 醋酸铵 100μl， 100%乙醇 750μl， RNA （10mg /ml） 2μl， 置-20℃ 2 小时后恢复到室温，在 1400rpm 离心 30min。

（4）小心将乙醇倒出，待试管内干燥后再用无菌 ddH2O 稀释到 10ng/μl 浓度。

（5）最终探针长度可于 10% 聚丙稀酰胺凝胶在 60℃ 的尿素中电泳检测。

2. 探针的长度 原位杂交反应中探针浓度应超过靶序列的浓度， 探针浓度必须给予该实验最大信噪比， 因为 背景着色度高低与探针浓度有关。

最佳探针浓度是最低探针浓度达到靶核酸的最大饱和结合 度为目的。探针浓度按其种类而略有不同，放射性标记 cRNA 探针的浓度为 0.5ng/μl，而非 放射性标记 cRNA 探针的浓度 1.0ng/μl。杂交液的量要适当，每张切片以 30~50μl 为宜。 保持杂交液不流失的关键是，载玻片的清洁处理必须彻底，应用杂交罩等也很必要。

3.杂交的温度和时间 设置和调整杂交温度是 RNA 原位杂交的重要环节。

杂交温度应低于解链或融解温度（melting temperature Tm）20-30℃。 多数 RNA 原位杂交 Tm 为 95℃， 由于这一温度对保存组织形态完整和组织切片的粘附将产 生不利影响， 为此在杂交液中常以增加甲酰胺浓度来降低 Tm 值， 因为每增加 1% 甲酰胺浓 度可降低 0.72℃。

另外杂交体中 GC 的百分比、杂交体长度以及杂交液中 Na+的浓度也与 Tm 呈正相关。 杂交反应的时间可随探针浓度的增加而缩短， 杂交时间过短会造成杂交不完全， 杂交时间过 长会增加非特异性着色。一般 RNA 原位杂交采用杂交孵育过夜，在黑暗环境下进行，可以 避免光线对甲酰 RNA 探针的制备 样本 DNA 的性质

1、 纯度：高纯度质粒提取试剂盒提取并纯化

2、 大小：100bp-10kb，大于 10kb 需要限制性内切酶的酶切

3、 含量：1ug 质粒 DNA→10ug 标记 RNA 样品制备

4、 在克隆插入位点下游，使用限制性内切酶将质粒线性化

5、 为了避免不需要序列的转录，使用限制性内切酶对 5‘段进行修饰

6、 酶切后，使用高纯化的 PCR 产物纯化试剂盒纯化或 工作液的准备 溶液 准备 储存 用途 水：PCR 级或 双蒸水中加入 0.1% 15-25℃ 调整溶液体积或 DMPC 处理水 methylpyrocarbonate resuspend RNA EDTA 0.2M ethylene-diamino- 15-25℃ 终止反应 Tetraacetic acid， pH 8.0 步骤标准 RNA 标记反应：

1、1ug 纯化的模版 DNA 或 4ul 对照 DNA 进行消毒，加足够的水至 13ul 体系

2、将反应物均放在冰上，然后加入下列试剂： 10×NTP labeling mixture 2ul 10×Transcription buffer 2ul Protector RNase inhibitor 1ul RNA Polymerase SP6 or 2ul RNA Polymerase T7 轻轻混匀并瞬时离心，37℃孵育 2h。

（长时间的孵育并不能增加标记 RNA） 3、加 2ul DNase I，除去模版 DNA;37℃孵育 15min（试剂盒可不做此步骤） 4、加 2ul 0.2M EDTA（pH8.0）终止反应。