Northern杂交实验指导之五：RNA探针制备
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五、RNA探针 制备(根据the DIG system user's guide)
A. 地高辛标记的体外转录
试剂及其配制(试剂盒提供)：
10× NTP标记混合物：in Tris-HCl (pH 7.5)
10mmol ATP
10mmol CTP
10mmol GTP
6.5mmol UTP
3.5mmol DIG-UTP
10× 转录 缓冲液：400mmol Tris-HCl(pH 8.0)
60mmol MgCl2
100mmol DTE(dithioerythritol)
20mmol亚精胺
100mmol NaCl
1unit/mlRNase抑制剂。
10unit/μl DNase I (RNase-free)
20unit/μl Rnase抑制剂
20unit/μl T7 RNA聚合酶和T3 RNA聚合酶
4mol/L LiCl
200mmol/L EDTA
DMPC-H2O
试验程序(带手套操作)
1.在一经DMPC处理并高压灭菌的无Rnase污染的微型离心管中依次加入下列反应物(离心管置于冰上)：线性化模板DNA 4μl(1μg)
10×NTP标记混合物 2μl
10×转录 缓冲液 2μl
DMPC-H2O 10μl
T3或T7 RNA聚合酶 2μl
2.轻轻混匀反应物，37℃保温反应至少2小时。
3.如果必要，向反应体系中加入2μl无Rnase污染的DnaseI，37℃下再保温反应15min.以除去残留的DNA模板(由于DIG标记的RNA转录量大大超过DNA模板量，因此，这一步有时也可以省略)。
4.向反应体系中加入2μl 200mmol/L的EDTA终止转录反应。
5.再向反应体系加入2.5μl 4mol/L LiCl和75μl冰冷100%乙醇，4℃下沉淀过夜
6.4℃下，12000rpm离心15min.，沉淀用70%冷乙醇洗涤一次，真空干燥。
7.沉淀按1μg/10μl的浓度重悬于DEPC-H2O中(每一反应体系约10μg)，并向其中加入20unit Rnase抑制剂，置于-20℃保存备测，检测后按一次杂交使用的体积分装再置于-70℃下保存。
DIG标记的RNA在-70℃条件下可以稳定地保存至少1年。
B. DIG标记有效性检测
RNA转录物能通过琼脂糖变性胶电泳检测其探针完整性。标记效果可通过抗DIG碱性磷酸酶直接检测，有两种方法可以选择。
方法一、用标准DIG测试条比较鉴定
使用测试条鉴定包括两个步骤：首先，将转录标记的RNA稀释成一系列的浓度，并点样到空白测试条上(对照测试条已用一系列浓度点样);其次，将点样的备测试条与对照测试条一起进行免疫、显色反应，然后根据对照测试条计算备测样品的浓度。
试剂及其配制
20×SSC：3mol/ NaCl(175g/L)
0.3mol/L 柠檬酸三钠•2H2O(88g/L)
pH 7.0
RNA稀释缓冲液：DMPC-H2O/20×SSC/甲醛(5:3:2)
Anti-DIG-AP
NBT溶液：75mg/ml NBT溶解在DMF(二甲基甲酰胺)中
BCIP溶液：50mg/ml BCIP溶解在DMF中
DIG空白试剂条：带正电荷的尼龙膜
对照试剂条：在相同膜上已用不同浓度的DIG标记DNA点样(300,100,30,10,3pg)
洗膜缓冲液：100mmol Maleic acid
150mmol NaCl
0.3%(v/v) Tween20
pH 7.5
Maleic acid缓冲液：100mmol Maleic acid
150mmol NaCl
pH 7.5
封闭液：5% (w/v) SDS
17mmol/L Na2HPO4
8mmol/L NaH2PO4
室温保存，如果需要，用0.45μm的滤膜过滤除菌。
检测缓冲液：100mmol Tris-HCl(pH 9.5)
100mmol NaCl
TE缓冲液：10mmol Tris-Cl (pH 8.0)
1mmol EDTA
试验程序(带手套操作)
1.将转录反应物稀释成浓度约为1μg/ml，即取前述转录标记物1μl加入99μlRNA稀释缓冲液，如果转录标记反应正常其浓度应大约为1μg/ml。
2.取5支Eppendorf管，按A、B、C、D、E顺序编号，将1μg/ml浓度的RNA标记物按下列方式稀释成一系列浓度：
编号 RNA标记物稀释方法 RNA终浓度
A 1μg/mlRNA 10μl+RNA稀释缓冲液23μl 300pg/μl
B 1μg/mlRNA 5μl + RNA稀释缓冲液45μl 100pg/μl
C A 5μl + RNA稀释缓冲液45μl 30 pg/μl
D B 5μl + RNA稀释缓冲液45μl 10pg/μl
E C5μl + RNA稀释缓冲液45μl 3 pg/μl
3.将空白测试条置于一聚酯膜上，以每一浓度1μl的量在测试条上点样，在聚酯膜上做好点样浓度标记，切勿直接在测试条上做任何记号，切勿用手接触测试条。
4.室温干燥约2min.，同时制备测试溶液。
5.在2ml封闭液中加入1μl Anti-DIG-AP。
6.显色底物溶液：在2ml检测缓冲液中加入9μl NBT溶液和7μl BCIP溶液。
7.准备5个样品池(2.5 ~ 5ml容量)，1～6顺序编号，依次加入2ml以下溶液。
①. 封闭液;
②. 抗体溶液(第5项);
③. ③④⑤洗膜缓冲液;
④. 检测缓冲液;
⑤. 显色底物溶液(第6项)
8.将样品测试条和对照测试条按下列顺序在上述准备的溶液中浸渍处理，两步骤直接让多余的溶液滴在吸水纸上。
①. 封闭， 2min.→
②. 抗体结合， 3min.→
①. 封闭， 1min.→
③. 洗膜, 1min. →
④. 平衡， 1min. →
⑤. 显色反应(黑暗)，5-30min.
9.显色反应30min.即停止反应(延长显色反应时间，会增加背景而影响结果比较)，用水漂洗测试条，将其置于3mm Whatman滤纸上空气干燥，然后在光下检测。
结果评估
显色反应进行5～10min.时，对照测试条中300pg浓度的样点即会出现颜色，30min.时3pg的样点也可见颜色，随即停止颜色反应。漂洗后比较对照与待测样品颜色，根据对照浓度与待测样品的稀释浓度计算标记物的数量。
如果标记物浓度低于10-30pg则不适宜采用这一快速检测方法。
方法二、用DIG标记的RNA对照比较检测
试剂：DIG标记的对照RNA(浓度约为100μg/ml)
其它试剂同方法一
试验程序
1.将DIG标记的对照RNA先稀释成20ng/μl(5μl对照RNA加入20μl DEPC-H2O)，取5支Eppendorf管以A、B、C、D、E、F顺序编号，将对照按下列比例稀释成一系列浓度：
编号 对照RNA稀释方法 终浓度
A 20ng/μl RNA 2μl+RNA稀释缓冲液38μl 1ng/μl
B A 5μl+RNA稀释缓冲液45μl 100pg/μl
C B 5μl+RNA稀释缓冲液45μl 10pg/μl
D C 5μl+RNA稀释缓冲液45μl 1pg/μl
E D 5μl+RNA稀释缓冲液45μl 0.1pg/μl
F E 5μl+RNA稀释缓冲液45μl 0.01 pg/μl
~undefined 稀释后的A-E可以在-70℃下至少贮存一年。
2.按照同样的方法将待测的DIG-RNA也稀释成一系列浓度，编号用1、2、3、4、5、6以便于与对照区别。
3.取一片尼龙膜，按照前述方法一的方法点样，第一排点对照，第二排点待测样，不必从浓度A开始，只需点C-F浓度进行检测。
4.用UV交联方法或尼龙膜也可采用120℃烘膜30min.的方法使RNA固定于膜上，再用洗膜缓冲液洗膜几秒种。
5.将膜置于封闭液中，室温下封闭30min.。
6.准备抗体溶液：用封闭液按1∶5000的比例稀释Anti-DIG-AP。
7.将膜置于抗体溶液中，室温下保持30min.，注意抗体溶液必须没过膜。
8.室温下用洗膜缓冲液洗膜2次，每次15min.。
9.再将膜置于检测缓冲液中2min.。
10.在10ml检测缓冲液中加入45μl NBT和35μl BCIP配制成显色底物溶液(现配现用)。
11.除去检测缓冲液，加入显色底物溶液，在黑暗下显色大约16小时(一般几分钟即可见开始显色)，注意在显色过程中，切勿振荡样品盘。
12.当颜色沉淀充分后，停止显色反应，用TE缓冲液或无菌水洗膜5min.。
13.比较对照和样品的颜色测算浓度。
