利用趋势线法计算起始拷贝数法

在进行荧光定量PCR实验中，Ct数值非常重要，因为通过对标准物质进行定量PCR实验绘制出标准曲线，进而利用标准曲线法求出未知样本中的起始拷贝数。

目前定量PCR仪器采用的是最大二阶导数法和样点拟合法计算Ct数值，其原因为实际工作曲线并没有相应的函数所能准确对应，因而采取以上两种方法。这里我举例说明一下使用样点拟合法计算Ct数值并进一步求算出起始拷贝数的过程。

y = 4.416x - 80.128 当y=1.64 时 x=18.52
y = 2.368x - 47.296 当y=1.64 时 x=20.67
y = 0.768x – 16 当y=1.64 时 x=22.97
y = 0.768x - 17.536 当y=1.64 时 x=24.97

起始拷贝数对数 7.3 6.3 5.3 4.3
样点拟合法计算出的Ct 18.52 20.67 22.97 24.97
利用样点拟合法求算出的工作曲线方程:
y = -2.165x + 34.34 R = 0.9996

为了验证其准确性，可以进行模拟计算，利用前3点绘制工作曲线，然后代入阳4的Ct数值，求起始拷贝数，然后与标准起始拷贝数对比
样点拟合法: y = -2.225x + 34.737 R = 0.9998
代入y=24.97 得 x=4.390
标准数值为4.301

趋势线法计算起始拷贝数法是利用对循环点对应的荧光强度进行趋势化，绘制其趋势曲线，然后通过代入荧光阈值计算出“趋势Ct”，绘制工作曲线，进而求算未知样本中的起始拷贝数。

还是利用上面那组数据，而改用趋势线法，利用计算出的前3个趋势Ct数值绘制工作曲线，然后代入阳4的趋势Ct数值，求起始拷贝数，然后与标准起始拷贝数对比。

前3条趋势线方程如下：

y = 36.179Ln(x) - 63.254
y = 36.371Ln(x) - 66.251
y = 28.716Ln(x) - 54.251
此时代入荧光阈值y=1.64分别求出对应的趋势Ct数值
起始拷贝数对数 7.3 6.3 5.3
趋势线法计算出的Ct 6.00 6.50 7.04
绘制工作曲线

y = -0.52x + 9.7893
R2 = 0.9995

利用第4条趋势线方程y = 21.824Ln(x) - 42.432计算出趋势Ct=7.55
将y=7.55 代入y = -0.52x + 9.7893
从而求得 Ct4=4.306 (标准为4.301)

利用趋势线法计算起始拷贝数的原理在于每一次实验采到的荧光强度曲线非常有规律，但是苦于不能找到对应的方程，为此可以变通的将他们的趋势进行方程化。这样一来，有了特定的方程，然后代入荧光阈值就可以准确的计算，结果比样点拟合法和最大二阶导数法更接近真实结果。

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