一、实验原理
Trizol的主要成分是苯酚,苯酚的主要作用是裂解细胞,使细胞中的核酸物质得到释放。同时苯酚虽可有效地变性蛋白质,但不能完全抑制RNA酶活性,因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase(RNA酶)。
0.1%的8-羟基喹啉可以抑制RNase,与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂,是一类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失,导致细胞结构降解,核蛋白迅速与核酸分离。
β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。利用Trizol试剂处理的样品加入氯仿后,经离心样品分成水样层、中间层和有机层。RNA存在于水样层中,收集水样层后可以通过异丙醇沉淀RNA。
二、实验试剂
Trizol试剂,DEPC,氯仿,异丙醇,DEPC处理水,75%的乙醇(DEPC水配制),植物乳杆菌05-19
三、实验仪器
恒温培养箱,常温离心机,低温离心机,移液器,电泳仪,电泳槽,紫外分析仪
四、操作步骤
接植物乳杆菌于MRS液体培养基中,于37℃的培养箱中培养过夜备用。
取菌液2 ml,12000 rpm离心2分钟,弃上清,加入1 ml Trizol 试剂 ,用枪吹吸,悬浮菌体,室温放置十分钟。
加入200 ul氯仿,盖紧 离心管 ,用手剧烈震荡15秒,4 ℃12000 rpm离心十分钟。
取上清(大约500 ul),加入等体积异丙醇,-20 ℃放置十分钟,4 ℃ 12000 rpm离心十分钟。
弃去上清,加入1 ml 75%乙醇,混匀,4 ℃ 12000 rpm离心五分钟。
小心弃去上清液,室温干燥5-10 min,注意不要过分干燥,否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶解到15 ul的DEPC处理水中。
进行琼脂糖凝胶电泳检测,并将剩余RNA保存于-70 ℃。
实验注意事项
整个操作要带一次性口罩及手套,并尽可能低温下操作。
加入氯仿后,首先混合均匀,吸取上清时,注意不要吸入中间层及有机相。
使用无RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染
配制溶液应使用无RNase 的水。