变化起始材料和洗脱条件

1. 纯化 FLAG 标记的人 pol II 全酶：

1.1 建立一个 HeLa 细胞衍生的、四环素调控的、条件性表达 FLAG 标记的人 pol II 亚基的细胞系。按照「条件性表达 FLAG 标记」步骤 1～20 描述的方法制备核抽提物、细胞质 S100 和核丸。

1.2 从核抽提物或 S100 中免疫亲和纯化 FLAG 标记的人 pol II 全酶，按照「组成型表达 FLAG 标记」步骤 26～34，但使用 BC100/1%（V/V）诺乃洗涤剂 P-40 作为洗涤和洗脱缓冲液。

2. 纯化 IIA 型 FLAG 标记的人 pol II：

2.1 从核抽提物或 S100 中免疫亲和纯化 FLAG 标记的人 pol II，按照基本方案 1 步骤 26～34，除了用含 1.0mol/L 尿素的 BC850/0.1% 诺乃洗涤剂 P-40 和 BC100 依次洗涤绑定蛋白的小珠 5 次，最后用含 0.2 mg/mlFLAG 肽的 BC100（FLAG 肽洗脱缓冲液）洗脱绑定的蛋白质。

含有高盐和尿素的洗涤破坏了 pol II 全酶中弱结合的多肽与 pol II 的作用，从而使得仅能回收 IIA 型的核心 pol II。核心 pol II 形成紧密结合的复合体能耐受髙盐和尿素洗脱。

3. 纯化 FLAG 标记的包含 IIA、IIB 和 IIO 型混合的人 pol II：

3.1 在 4℃ 下或冰上用 70 ml 缓冲液 B，缓慢搅动 35 ml 从 hRPB9-3 细胞分离得到的核丸，然后用 11 ml3mol/L 硫酸铵调整硫酸铵浓度至 0.3mol/L。再搅动 30 min。hRPB9-3 是一个衍生于人 HeLa 细胞、条件性表达 FLAG 标记的人 RNA 聚合酶 II RPB9 亚基的细胞系。

缓冲液 B 与硫酸铵一起使用，其中镁离子和高盐浓度可以帮助从染色体组分解离 pol II 复合体，并同时保持 pol II 的活性。

3.2 超声 5 次，在冰水浴中每次 1 min，每两次超声之间间隔 20 s。

3.3 4℃ 185000 g 离心 90 min（Beckman45-Ti 转子 40000r/min），将上清倒入一个 500 ml 烧杯。

3.4 用一个注射器逐滴加入 2 体积缓冲液 B，逐渐将硫酸铵浓度调整至 0.1mol/L。

3.5 185000 g 离心 60 min 去除沉降物，将上清倒入另外一个烧杯。

3.6 缓慢加入固体硫酸铵至 65% 饱和（即 0.42 g/ml 悬浮液），沉降 pol II，再搅拌 30 min.

3.7 142000 g 离心 60 min，用 40 ml 缓冲液 D 重悬沉淀。

3.8 在 4 L BC100 中透析 6 h，至少换一次缓冲液。最终回收的样品是约 46 ml。

3.9 免疫亲和纯化 FLAG 标记的包含 IIA、IIB 和 IIO 型混合的入 pol II 按照基本方案 1 步骤 26～34，在最后用含 0.2 mg/ml FLAG 肽的 BC100（FLAG 肽洗脱缓冲液）洗脱之前用含 1.0mol/L 尿素的 BC850/0.1% 诺乃洗涤剂 P-40 和 BC100 依次洗涤绑定蛋白的小珠 5 次。

含有高盐和尿素的洗涤破坏了 pol II 全酶中弱结合的多肽与 pol II 的作用，从而使得只能回收含有不同磷酸化状态的核心 pol IIO 在最终用 FLAG 肽 BC100 洗脱缓冲液洗脱之前有必要用 BC100 平衡固化了的复合体。