组成型表达FLAG标记

首先通过逆转录病毒介导的转基因（用于组成型表达）或四环素调控的系统（用于可诱导表达）建立表达抗原决定簇标记的蛋白复合体亚基的稳定细胞系。然后用抗原决定簇特异的单克隆抗体偶联的小珠进行免疫亲和纯化，以沉降抗原决定簇标记的多亚基蛋白复合体。最后在中性 pH 或生理条件下洗脱回收，即可用于功能试验。

1. 将 FLAG 标记蛋白编码序列克隆到含有药物筛选标记（如新霉素）的逆转录病毒载体。

2. 转移 20 μg 到 5 ml 圆底 Falcon 试管中并与 0.5 ml 2 × HeBS，pH 7.12 混合。

3. 逐滴加入 0.5 ml 0.25 mol/L CaCl₂ 同时涡旋混匀。室温放置 20～30 min。

4. 激烈涡旋混匀 DNA-磷酸钙共沉降物，将混合物加入 50% 汇片的 ψ CRIP 细胞，这些细胞用含 10% 小牛血清的 DMEM 培养在 100 mm 组织培养皿中。37℃，5% CO₂ 培养 3 ～4 h。

5. 移出培养基加入 3 ml 15%（V/V）甘油/DMEM，室温放置 3 min。

6. 加入 8 ml DMEM 以快速稀释甘油，混匀，然后移出溶液。

7. 重复洗涤 3 次，每次用 3 ml DMEM。

8. 加入 10 ml 含 10% 小牛血清的 DMEM 至转染了的细胞，37℃、5% CO₂ 培养 18 h。

9. 用 0.45 μm 醋酸纤维素注射滤器过滤细胞培养上清液（甘油休克 18 h 后）以去除悬浮细胞和大的细胞碎片，将病毒颗粒收集于 15 ml 无菌试管。

10. 用 1 ml 含 10% FBS 的 DMEM 和聚凝胺（终浓度为 8 μg/ml）与 1 ml 过滤后的病毒储液混合。混合物与 50% 汇片的 HeLa 细胞在 37℃ 共孵育 2.5 h，间歇混合。这些细胞用含 10% FBS 的 DMEM 培养于 100 mm 细胞培养皿中，并且用培养基预洗了 2 次。

11. 额外加入 8 ml 含 10% FBS 的 DMEM，不要移除起初转染的培养基，37℃ ，5% CO₂ 培养 1～1.5 天。

12. 分出 1/5 的细胞到含有药物的培养基，每 3～4 天更换选择培养基。抗性克隆通常 2～3 周后可见。

13 . 准备一个 24 孔板，隔一个孔加入 2 滴（约 100 μl）胰酶-EDTA 以避免相邻孔之间的交叉污染。

14. 用黑色（或蓝色）记号笔把将要挑出的药物抗性克隆用圆圈圈出（直径为 2～3 mm）。移除培养基，用 1 × PBS 洗涤细胞 1 次，然后移除溶液。

15. 用 200 μl 吸头从第一个孔取约 50 μl 胰酶-EDTA，在圆圈圈住的克隆处吸打数次后转移回第一个孔。

16. 重复转移总共 12 个克隆。

17. 每一孔加入 1～2 ml 选择培养基。将 24 孔细胞培养板放回 37℃，5% CO₂ 培养箱使细胞贴壁生长。基于转移的活细胞数，孔内细胞汇片可能需要 3～14 天。

18. 当 24 孔板中的细胞汇片时将其转移至一个 60 mm 的细胞培养皿中以继续单个细胞克隆的扩增。

19. 当细胞在 60 mm 细胞培养皿中接近汇片的时候，再次将细胞分到一个 60 mm 细胞培养皿和两个 100 mm 细胞培养皿中。在 100 μl 细胞培养皿中培养的细胞将要冻存为单独的克隆化细胞系。

20. 在用 1 × PBS 洗涤 2 次过后，加入 300 μl 1 × SDS 聚丙烯酰胺蛋白上样缓冲液至生长在 60 mm 细胞培养皿中达到 80%～90% 汇片的细胞中，以制备总细胞裂解液。用枪头多次吸打裂解液直到样品没有黏性，然后将样品转移至 1.5 ml 微量离心管中。

21. 用抗 FLAG M2 单克隆抗体和（或）抗蛋白抗体对每个收集到的总细胞裂解液进行免疫印迹以鉴定表达 FLAG 标记蛋白的细胞克隆。

22. 通过调整至悬浮培养的方法，选择一个表达 FLAG 标记蛋白的阳性克隆做进一步扩增。合并 12 中 100 mm 细胞培养皿的细胞至一个 250 ml 旋转摇瓶中，用含 10% FBS 的 Joklik 培养基将细胞密度调整至 0.5 × 10⁶ 细胞/ml。使细胞以同样的密度在含 10% FBS 的 Joklik 培养基中保持 3 天以上。如果细胞健康并且接近指数增长，则开始用含 10% 小牛血清的 Joklik 培养基培养细胞。继续用含 10% 小牛血清的 Joklik 培养基培养细胞至少 3 天。如果细胞仍然看起来健康并且生长旺盛，则开始用含 7.5%（或 5%）小牛血清的 Joklik 培养基培养细胞。

在扩增和血清转换/减少的过程中，如果细胞看起来不健康或细胞密度减少，将细胞 300 g 离心 5 min，用含相同浓度小牛血清的新鲜知 Joklik 培养基重悬，这能帮助去除细胞碎片。重新调整细胞密度至 0.5×10⁶ 细胞/ml。一旦细胞健康且继续生长就开始按前述方法降低血清的浓度。重复这个过程直到细胞维持于含 5% 小牛血清的 Joklik 培养基中。

23. 连续培养和扩增生长在含 5% 小牛血清的 Joklik 培养基中的细胞至 20 L 或其他想要的体积。

24. 按照 12.1制备核抽提物、细胞质 S100 和核丸（或染色体组分）。

25. 用免疫印迹来识别包含 FLAG 标记蛋白的细胞组分。

26. 加入 0.4 ml 抗 FLAG M 2 的单克隆抗体偶联的小珠至装有 10～14 ml 核抽提物（或 S100，或溶解了的核丸）的 15 ml 试管，这些小珠预先用 BC100 洗涤几次。在一个试管旋转仪中将样品于 4℃ 孵育 6～12 h。

27. 4℃ 300 g 离心 1 min，将上清和小珠分离。

28. 弃上清，用 BC300/0.1% 诺乃洗涤剂 P-40 洗涤绑定着蛋白质的小珠 5 次。

包含诺乃洗涤剂 P-40 防止蛋白质/小珠聚集，也有助于在洗脱过程中免疫亲和小珠更好地旋转。

29. 转移带有绑定蛋白质的 M2 偶联的小珠至一个微量离心柱中。

30. 最高速度（10000 r/min）离心 10 s 以去除残留液体。

31. 加 0.5 ml BC300/0.1% 诺乃洗涤剂 P-40 及 0.2 mg/ml FLAG 肽至干燥的小珠。充分混匀，4℃ 连续旋转孵育 20～60 min。

32. 4℃ 离心 10 s 收集洗脱液（也就是第一次洗脱）。

33. 重复洗脱（步骤 31 和 32）（总共）4 次以得到绝大部分的 FLAG 标记的蛋白复合体。

34. 分装样品成小份（如 20 μl） 于 0.5 ml 微量离心管，然后用液氮速冻。将纯化了的复合体小份储存于 -80℃ 直到使用。

通常对 HeLa 细胞所使用的药物浓度依赖于单个药物筛选标记，分别是：G418（总重）为 1 mg/ml，潮霉素为 0.2 mg/ml 或 0.5 μg/ml 嘌呤霉素。额外细节见转染哺乳动物细胞选择实验。