条件性表达FLAG标记

有时导入的 FLAG 标记蛋白编码序列在逆转录病毒介导的转基因和药物筛选建立的克隆化细胞系中不表达。这可能是由于外源基因产物没有被调控的或组成型表达所造成的细胞毒性。为了克服这个问题，基于四环素的使用，一个可诱导的哺乳动物表达系统可以用来“打开”或“关闭” FLAG 标记蛋白的表达。在建立表达 FLAG 标记蛋白细胞系的过程中，持续加人四环素以沉默外源基因表达。进而用存在和不存在四环素时收集的总细胞裂解液进行免疫印迹来筛选单个细胞克隆的可诱导性。一旦鉴定出来，就把可诱导的细胞系调整至适应悬浮培养，去除四环素后，用于 FLAG 标记多亚基蛋白复合体的免疫亲和纯化。

1. 将蛋白编码序列克隆到一个含有 FLAG 抗原序列的四环素调控表达的质粒中，如 pTetCMV-F°（S）。

2. 混合 10 μg 线性化的四环素调控的 FLAG 标记蛋白表达质粒 [如使用 PvuI 来线性化大多数 pTetCMV - F°（S）衍生构建物] ，50 μg 剪切过的小牛胸腺 DNA 和 0.5 μg SacI 线性化、含有潮霉素筛选标记的 pREP4 至电穿孔杯。

3. 胰酶-EDTA 处理后合并几个 100 mm 细胞培养皿的 HtTA-1 细胞（或其他表达四环素调控的反式激活因子的细胞）至一个 50 ml Falcon 试管，这些细胞培养在含 10% FBS 0.6 mg/ml G418 的 DMEM 中。300 g 离心 5 min，重悬细胞于含 10% FBS 和 5 mmol/L BES 缓冲液 pH 7.2 的 DMEM 中，密度为 2 × 10⁷ 细胞/ml。

4. 用一个 200 μl 吸头分 2 次，每次 125 μl，将 250 μl 重悬细胞转移至装有质粒和载体 DNA 的电穿孔杯中（见步骤 2），吸打数次混匀。

5. 用 Bio-Rad Gene Pulser II 将 DNA 穿孔进入细胞，设置为 960 μF 和 200 V。室温放置 10 min，然后用一个一次性玻璃吸头将细胞转移至一个装有 10 ml 含 10% FBS 的 DMEM 的离心管里。

6. 300 g 离心 5 min。吸弃上清，其中含有未被转化的 DNA 和电穿孔产生的细胞碎片。

7. 重悬细胞于 5 ml 含 10 % FBS 的 DMEM， 分布于 5 个 100 ml 细胞培养盘，每个装有 9 ml 含 10% FBS 的 DMEM，37℃ 5% CO₂ 培养箱放置 2 天。

8. 药物筛选从把培养基换成含有 400 μg/ml G 418、200 μg/ml 潮霉素 B 和 2 μg/ml 四环素、10% FBS 的 DMEM 开始。

9. 每 3～4 天换一次培养基，继续药物筛选约 3 个星期直到药物抗性克隆清晰可见。

10. 按照基本方案 1 步骤 13～18，挑 12～24 个药物抗性克隆并将其扩增成为细胞系。

11. 当在 60 mm 细胞培养皿的细胞接近汇片时，将细胞分至一个 100 mm 细胞培养皿和两个 60 mm 细胞培养皿。

生长在 100 mm 细胞培养皿的细胞将要作为单独的细胞系冻存。生长在两个 60 mm 细胞培养皿的细胞分别放入含有和不含有四环素的选择培养基中培养 48～72 h。

12. 在用 1 × PBS 洗涤 2 次过后加入 300 μl 1 × SDS 聚丙烯酰胺蛋白上样缓冲液至生长在 60 mm 细胞培养皿中的细胞中，以制备总细胞裂解液。用枪头多次吸打裂解液直到样品没有黏性，然后将样品转移至 1.5 ml 微量离心管中。

13. 用抗 FLAG M2 单克隆抗体和（或）抗蛋白抗体对每个收集到的总细胞裂解液的一小份进行免疫印迹以鉴定仅在无四环素时表达 FLAG 标记蛋白的细胞克隆。

14. 选择一个表达 FLAG 标记蛋白的阳性克隆，通过调整至悬浮培养的方法做进一步扩增。合并 12 个 100 mm 细胞培养皿的细胞至一个 250 ml 旋转摇瓶中（细胞密度至 0.5 × 10⁶ 细胞/ml），渐渐将培养基从 DMEM 10% FBS 替换成含 10 % 小牛血清的 Joklik 培养基，最终至含 5% 小牛血清的 Joklik 培养基。但是在扩增过程中培养基中包含 1 μg/ml 四环素和 0.6 mg/ml G418 直到培养体积达到 250 ml。

15. 继续在含有四环素的培养基中扩增细胞，但是培养体积达到 250 ml 以后不用 G 418。

16. 在细胞扩增到 12 L 后，在 250 ml 无菌锥形试管中 300 g 离心 5 min 去除四环素。重复操作直到所有细胞收集到两个 250 ml 锥形试管中。

17. 用 250 ml 1 × PBS 洗涤细胞团聚物。300 g 离心 5 min。重复洗涤 4～6 次。

18. 重悬细胞于 120 ml 无四环素的 5% 小牛血清 Joklik 培养基中，将细胞分至 6 个装有 1.5 L 含 5% 小牛血清 Joklik 培养基的 12 L 瓶中。

19. 蛋白质诱导 4 天后，每天培养基增加一倍，按照 12.1 制备核抽提物、细胞质 S100 和核丸（或染色体组分）。

20. 用免疫印迹来鉴定含有 FLAG 标记蛋白的细胞组分。

21 . 按照「组成型 FLAG 标记」步骤 26 ～34 描述的方法， 对 FLAG 标记蛋白复合体免疫亲和纯化。

诱导蛋白表达在悬浮细胞中往往比单层细胞中耗时更多。时间进程研究的结果表明，4 天后诱导的 FLAG 标记蛋白达到最大量，一定程度上是由于在大体积的悬浮培养基中使用便宜和低浓度的小牛血清可以减少倍增时间。每天培养基加倍使细胞处于轻微稀释的条件下，诱导效率更高。