用P11离子交换层析柱

人 TATA 结合蛋白（TBP）能够结合不同类型的细胞内蛋白以形成不同的蛋白复合体，如 SL1、TFIID 和 TFIIIB。这些蛋白质分别是通过 RNA 聚合酶 I、II 和 III 的转录所必要的。所有这些不同的蛋白复合体在核抽提物中都能找到。用一个层析步骤，如 P11 离子交换柱，把含 TBP 的不同的复合体分离成为不同组分，然后进行免疫亲和纯化。

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P11 离子交换树脂
各种 BC 缓冲液（BC100、BC300、BC500、BC850 和 BC1200）
层析柱（容积约 100 ml） 流体适配器图表记录器样品收集器 透析管（MWCO 12000）

1. 用逆转录病毒介导的转基因建立一个 HeLa 细胞衍生的表达 FLAG 标记的人 TBP 的细胞系，并且按照基本方案 1 步骤 1～24，从建立的细胞系中制备核抽提物、S100 和核团块。

2. 在一个层析柱中装一个约含 60 ml 树脂的 P11 离子交换柱。

3. 将柱连到一个流体适配器、图表记录器和样品收集器上，用 BC100 平衡整个系统过夜。流速设置为每小时约 1 个柱体积（CV），即 1 ml/min。

4. 4℃ 时在一个冰桶中融化约 100 ml 核抽提物过夜。

5. 4℃ 时将核抽提物 105000 g 离心 20 min。

6. 上清倒入 50 ml 试管以 1 CV/h 的流速上样至已平衡的 P11 柱。用样品收集器收集洗出物，约 12 ml 每管。

记住保留一小份（约 100μl）进行免疫印迹分析。

7. 用约 2 CV 的 BC100 洗涤柱子直到在 280 nm 的吸收值几乎达到基线。

8. 当每种洗脱缓冲液的蛋白质曲线几乎接近基线时，相继转换到 BC300、BC500、BC850 和 BC1200 进一步洗脱结合蛋白。

9. 混合对应 BC100、BC300、BC500 和 BC850 蛋白峰的组分。

10. 将 BC500 和 BC850 样品在 4L BC100 中 4℃ 透析 5 h。

11. 将样品 46000 g 4℃ 离心 15 min。

12. 将 BC500 和 BC850 的上清，以及 BC100 和 BC300 组分，单独地分装到几个 15 ml 试管（做免疫亲和纯化）和 1.5 ml 微量离心管（做免疫印迹和蛋白质分析）。

13. 液氮冷冻，存放于 -80℃ 直到使用。

14. 用免疫印迹来定位包含 FLAG 标记 TBP 的 P11 组分。

15. 按照「组成型表达 FLAG 标记」 步骤 26～34，从 P11 0.3mol/L 氯化钾组分纯化 TFIIIB 以及从 P11 0.85mol/L 氯化钾组分纯化 TFIID。

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