免疫组化常见十大问题与解析

图 1 实验流程与常见问题索引

Q1：染色结果呈阴性，是怎么回事？

（1）抗体来源选择错误：本试剂盒二抗为抗兔/鼠，请确保一抗来源的种属为兔源或鼠源。

（2）组织切片本身不存在目的蛋白：可通过 The Human Protein Atlas 数据库或 UniProt数据库查询目的蛋白在细胞或组织中的表达情况。

（3）抗体浓度和质量问题：提高抗体工作浓度或延长孵育时间；确认抗体可进行IHC实验，通过非IHC实验排除抗体质量问题。

（4）脱蜡不完全：可根据切片上是否存在透明颗粒，判断是否存在脱蜡不完全，若存在，需延长脱蜡时间或换用新的二甲苯。

（5）抗原修复不完全：对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合。

（6）细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应：可加入组织透化步骤，进行细胞膜或核膜的透化。

（7）试剂盒保存不当：请于 4℃ 进行保存，勿室温防止过长时间。

（8）封闭时间过长：若使用封闭液进行封闭，请排除封闭液对抗原抗体结合的影响。

Q2：免疫组化染色弱怎么办？

（1）抗体浓度过低，孵育时间过短：可提高抗体浓度，进行抗体4℃过夜孵育。

（2）组织或细胞中目的抗原表达水平低：可延长DAB显色时间或延长二抗孵育时间。

（3）试剂超过有效使用期：及时更换试剂。

（4）操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释：可每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥）。

（5） 蛋白封闭过度：封闭时间不要超过 2h。

Q3：为什么出现高背景染色，怎么办？

（1）一抗浓度过高：对抗体进行滴定以确定获得特异性反应的最佳浓度。

（2）显色过度：缩短显色试剂 DAB 孵育时间。

（3）洗涤不充分：适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间。

（4）封闭不完全：使用正常山羊血清或 1%～5% BSA 封闭 1h。

（5）离子相互作用造成的背景：降低抗体稀释液的离子强度。

（6）切片或细胞过于干燥或孵育温度过高：实验过程中请保持切片处于湿润状态，一抗孵育时尽量使用 4℃ 过夜孵育。

（7）内源性过氧化物酶残余：适度延长内源性过氧化物酶阻断剂阻断时间。

（8）样本于缓冲液或抗原修复液中浸泡太久：样本在溶液中浸泡时间不要超过 24h。

Q4：为什么会出现非特异性染色，如何避免？

（1）抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加非特异性染色：由于本试剂盒使用 Polymer二抗进行了反应的放大，该方法敏感性较高，可缩短抗体孵育时间或降低抗体浓度。

（2）内源性过氧化物酶残余：适度延长内源性过氧化物酶阻断剂阻断时间。

（3）一抗导致的非特异性染色：多克隆抗体易于产生非特异性染色，结合抗体官网信息合理选择多克隆抗体或单克隆抗体。

（4）一抗种属来源与组织样本来源相同：如使用鼠源一抗检测小鼠组织，尽量选择种属来源与样本种属不同的一抗。

（5）切片或细胞过于干燥：实验过程中，需保持样本的湿润。

Q5：阳性染色细胞定位不正确，如何修正？

（1）抗原修复条件不合理：尝试改变抗原修复条件。

（2）固定方法不合理：可能由于不合理或不及时的固定导致抗原破坏，出现抗原弥散的现象，可尝试不同的固定剂或增加固定时间。

（3）离子相互作用影响抗原识别：尝试调整抗体稀释液的 pH 值或阳离子浓度。

 Q6：切片边缘着色，怎么调整？

（1）样本边缘粘贴不牢，边缘松脱漂浮在液体中：增加清洗次数或延长清洗时间。

（2）试剂未完全覆盖样本：边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心高而致染色深。免疫组化笔画圈应距组织边缘大于 3～4 mm，试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘 2 mm。

Q7：阴阳脸着色，到底是为什么？

即组织一半着色一般不着色：一般见于试剂分布不均匀或由于气泡导致的着色不均匀。试剂滴加后，应检查试剂是否分布均匀，可使用枪头将试剂引流开使之将组织全部覆盖。若滴加时易产生气泡，则滴加试剂时手法要轻，有气泡时用枪头捅破。

Q8：总是脱片，如何优化？

（1）烤片时间不够，或温度不够：可以延长烤片时间和提高烤片温度。

（2）用含有多聚赖氨酸的玻片。

（3）组织差异：有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，进行清洗操作时洗涤液不要直接冲洗组织。

（4）使用高温修复时，温度骤冷：进行高温抗原修复时，需等待液体缓慢恢复至室温。

（5）冰冻切片未进行复温：冰冻切片应先于室温放置到复温后再浸泡至PBS中。

Q9：染色强度不均匀怎么办？

（1）切片厚度不均匀：切片的厚薄不一，可能导致染色呈现一边强，一边弱的情况。

（2）DAB 染色液未混匀：DAB 在样本上的浓度不一致，导致染色不均匀，加完显色液后最好将片子来回左右晃动几下，使片子上所有区域的底物浓度一致。

（3）试剂未完全覆盖样本：边缘易由于未覆盖而导致无染色或弱染色。免疫组化笔画圈应距组织边缘大于 3～4 mm，试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘 2 mm。

Q10：灶片状着色，如何调整？

（1）洗涤液的残留：洗涤液的残留可能导致其对后续试剂产生稀释作用，需尽量甩干样本残余洗涤液。

（2）坏死组织灶，组织坏死后细胞破坏、酶的释放、蛋白游离、分解，复杂的肽链残段可能与一抗或/和二抗结合影响最终着色，因此在选择染色切片时应避免选择坏死组织较多的切片。

附实验小 Tips