组化染色背景高？没信号？一篇文章带你快速掌握免疫组化！

免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种以抗原抗体特异性反应为基础，对组织或细胞中特定抗原（通常是蛋白质）的定性和定位分析的实验方法。免疫组化可以在微观层面上反映出疾病过程中细胞内蛋白质的表达变化，对于病理诊断和研究具有重要价值。通常，根据显色剂（酶、荧光素、同位素、 金属离子等）与样品类型的不同，将免疫组化作以下分类。

图 1 免疫组化病理分类

IHC/ICC（统称为免疫组化）是指通过酶标记物在组织、细胞原位通过抗原抗体反应和化学的显色反应，对特定抗原进行定性和定位。

IF（免疫荧光检测）是采用荧光素标记物作为探针，形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，受激发光的照射后发出一定波长的荧光，从而对细胞、组织中的抗原进行定位或定量。

表 1 IHC/ICC与IF特点对比

IHC/ICC 与 IF 染色中使用的抗体主要为一抗与二抗，根据是否选用二抗以及二抗标记物类型可形成多种不同的检测系统。信号放大是免疫组化实验中的重要步骤，信号放大可以使目标蛋白质的信号从微弱到明显，从而更容易被观察和定量。现有的信号放大技术多为链霉亲和素-生物素法，该方法基于链酶亲和素与生物素高度特异性结合的关系来放大免疫组化信号，但此方法有产生内源性生物素背景的可能性。而酶标聚合物法，利用聚合物与二抗结合，形成聚合物-二抗复合物，实现信号放大，该方法不受内源性生物素的干扰。

表 2 免疫组化多种检测系统分类

图 2 酶标聚合物法检测系统

图 3 链霉亲和素-生物素法检测系统

在显色法中，针对 HRP（辣根过氧化物酶）显色系统，其常用底物为DAB/AEC（HRP/DAB 呈棕褐色染色，具有很好的光稳定性，HRP/AEC 呈红色染色，在阳光下会褪色，不易保存。

基础 IHC 染色通常需要样品制备、抗原修复、封闭、目的抗原检测等操作。IHC 实验成功的关键在于稳定、优化且可重复的染色方案。下图为 IHC 的实验操作步骤。

图 4 IHC操作步骤

免疫组化样本固定多使用甲醛进行固定，通过形成亚甲基桥而将蛋白交联起来，掩盖掉抗原位点，从而影响抗原-抗体的结合。抗原修复则会破坏这些亚甲基桥，暴露出抗原位点，使抗体能够与之结合。用于抗原修复的两种方法分别为热诱导表位修复法和酶修复法。

表 3 抗原修复方式分类

图 5 免疫组化实验检测 Phospho-Akt 表达

注：使用 Anti-phospho-Akt (Ser473) Rabbit mAb 对石蜡包埋的人乳腺癌组织进行免疫组织化学分析。（图 A）使用免疫组化试剂盒M&R HRP/DAB Detection IHC Kit，抗体 1:100 稀释；(图 B) 采用普通免疫组化试剂盒，抗体 1:25 稀释。

图 6 免疫组化实验检测 Erk1/2 表达

注：使用 Anti-Erk1/2 Mouse mAb与p44/42 MAPK （Erk1/2）Rabbit mAb 对正常小鼠心脏组织进行免疫组织化学分析。（图 C）使用Anti-Erk1/2 Mouse mAb 鼠单抗进行目的蛋白检测；(图 D) 使用p44/42 MAPK （Erk1/2）Rabbit mAb 兔单抗进行目的蛋白检测。

图 7 免疫组化实验检测Akt表达

注：使用 Anti-Akt (pan) Rabbit mAb 对正常小鼠肝组织进行免疫组织化学分析。（图 E）使用免疫组化试剂盒 M&R HRP/DAB Detection IHC Kit，抗体1:100 稀释；(图F)使用另一种试剂盒，抗体 1:100 稀释。