PKH 不适合染外泌体？看看文献怎么说
天九再生医学（天津）科技有限公司
亲脂性荧光染料分子如PKH家族已被广泛用于外泌体标记。有研究使用纳米颗粒跟踪分析（NTA）系统地评估了PKH标记对外泌体尺寸的影响，所有被PKH标记外泌体的尺寸均明显增加[1]，并引入了假阳性结果[3]，故认为PKH不是示踪外泌体的可靠技术。
PKH容易引入假阳性
PKH可在四个方面引起假阳性：
1. 染料聚集造成的假阳性
研究表明，PKH的聚集会在体系中引入了新的非外泌体纳米颗粒。如下图（Fig.1）PKH（不含EV）在NTA下观测到大量纳米颗粒，可能是胶束和聚集体，颗粒分布在80-400 nm，与外泌体所在的粒径区间（30-150 nm）存在交集，这与之前报告的结果一致[2, 3]。PKH聚集而成的纳米颗粒自身的荧光干扰不容忽视，Lai 等人[4]研究表明用 PKH67 染色（没有 EV）甚至比 PKH67 染色的 EV 具有更强的荧光信号，这些同样具有荧光的纳米颗粒会“伪装”成外泌体，影响标记阳性率、外泌体粒径分布和细胞摄取结果。
Fig.1 NTA视频观察到大量聚集的PKH颗粒
2. 弥散造成的假阳性
未除尽的PKH会弥散进入细胞，同时标记细胞膜，引起观测的假阳性（Fig.2）。PKH染色下，本应仅可见外泌体的荧光探针同样表现出了细胞膜轮廓；
Fig.2 EvLINK和PKH标记外泌体的荧光共聚焦拍照
3. 二次标记造成的假阳性
由于外泌体膜与细胞膜结构的相似性，常规染料标记的外泌体在被细胞摄取后一旦脱落，会二次标记细胞膜带来非外泌体荧光信号；
4. 非外泌体标记造成的假阳性
PKH作为一款亲脂性染料，并不具备膜特异性，外泌体中的脂质颗粒状杂质同样会被PKH标记上，带来观测结果的假阳性。
PKH标记率高？可能外泌体并不纯
尽管外泌体膜和细胞膜结构组成相似，但并不意味着细胞膜染料可以适用于外泌体标记，主要是由于外泌体和细胞中存在的杂质、以及杂质的去除难度大大不同。PKH作为一款亲脂性染料，并没有较强的特异性。以较简单途径（如超速离心法、PEG沉降法）纯化的外泌体体系中含有大量的脂质微粒，如脂蛋白，这些脂质微粒同样会被PKH标记，带来虚假的标记率和观测的假阳性。
PKH对外泌体尺寸的影响
已有的研究表明，细胞优先摄取较小的外泌体[5]，因此改变外泌体的大小可能影响它们被靶细胞的摄取。
1. PKH的标记显著增加外泌体粒径
在用PKH标记EV后，NTA检测到比单独的EV或PKH中发现的颗粒更大的颗粒，这表明PKH标记后外泌体粒径增大（Fig.3）。
Fig.3 NTA表征Ev与PKH的粒径分布
为了证实PKH是造成标记外泌体粒径增加的原因，实验设计了100 nm聚苯乙烯（PS）颗粒（不被PKH标记）+PKH体系作为对照实验。当向PKH中添加100 nm PS颗粒时，NTA没有观察到尺寸向较大颗粒的转变（Fig.4）。因此认为PKH标记外泌体可使其粒径增加。
Fig.4 NTA表征PS与PKH的粒径分布
2. 降低PKH浓度无法平衡EV粒径与可观测性
尺寸增加的可能机制是PKH纳米颗粒与EV的聚集/融合或PKH分子插入EV膜，那么是否可以通过降低PKH浓度来最小化尺寸增加，同时保持来自PKH标记的EV的可检测荧光信号呢？
Fig.5 不同浓度PKH与标记后的外泌体的荧光图像
将PKH稀释至荧光降低至检测限（0.16 μM），尽管该浓度下已经难以检出荧光信号（Fig.5），但依然可以观测到PKH引起的外泌体粒径的增加（Fig.6）。
Fig.6 PKH浓度对标记后外泌体尺寸的影响
3. PKH影响不同浓度EV的粒径
通过改变EV的浓度测试PKH对不同浓度外泌体的影响，NTA结果可见，无论被测试的EV浓度如何，被PKH标记后都可观测到粒径的增大（Fig.7）。
Fig.7 PKH标记后对不同浓度外泌体粒径的影响
在降低PKH染料用量或降低外泌体浓度下都不可避免的造成外泌体粒径显著增大。Kulkarni等人[6]研究了静脉注射聚苯乙烯纳米粒子在大鼠不同器官中的生物分布。与 100 nm 颗粒相比，200 nm 颗粒在肝脏和脾脏中的蓄积量更高。
总之，由 EV 的 PKH 标记引起的向较大颗粒的尺寸转变可能会改变细胞摄取水平和内化机制以及 EV 的生物分布，从而降低其作为 EV 示踪剂的有效性。
EvLINK，更优的外泌体染料
EvLINK 505/555 是天津外泌体科技自主研发的基于共价偶联的外泌体膜特异性荧光标记探针，避免了上述四大假阳性：
1. 非亲脂性染料，无聚集趋势，避免了因染料聚集带来的假阳性；
2. 不弥散，仅标记外泌体膜轮廓，且经过标准protocol可完全去除，不误标记细胞膜；避免了因染料弥散进入细胞带来的假阳性；
3. 不二次标记，偶然脱落的EvLINK会立刻失活，不会二次标记细胞膜，避免了染料脱落后二次着色细胞膜带来的假阳性；
4. 膜特异性，不标记脂质杂质，避免了非外泌体标记带来的假阳性。
Fig.8 EvLINK 505标记外泌体+CellLINK 555标记细胞膜双染（上）和EvLINK 555标记外泌体+CellLINK 505标记细胞膜双染（下）
此外，EvLINK 最大限度的保留了外泌体的形态、结构及生物学功能，不会引起明显的粒径变化（Fig.9）。
Fig.9 被EvLINK （a）标记后和（b）标记前的外泌体的TEM图像；被EvLINK （c）标记后和（d）标记前外泌体的粒径分析（nanoFCM）;（e）EvLINK标记前后的外泌体Western blot：左为标记前的外泌体，右为经EvLINK标记后的外泌体
EvLINK，支持多种外泌体研究场景
1. 外泌体摄取
EvLINK+CellLINK双染策略，可以彻底解决外泌体摄取实验中的假阳性问题。
Fig.10 EvLINK 505标记外泌体（绿）被CellLINK 555标记细胞（红）摄取
2. 外泌体体内示踪
EvLINK 555深红色外泌体示踪染料，特异性标记外泌体外膜，不二次标记、脱落即“灭”，帮助科学家以极低成本回答外泌体“去哪里”的难题。
Fig.11 EvLINK 555标记的外泌体小鼠灌胃后的体内脏器分布
3. 外泌体活体示踪
即将面世的EvLINK 800，用于外泌体活体示踪，预计12月上市，敬请期待。
天津外泌体科技研发的高特异性、高标记率的EvLINK外泌体荧光标记探针，具有不聚集、不弥散、不二次标记、保留外泌体结构及功能等优势，仅需30 min即可完成标记，可与其他染料结合，轻松示踪外泌体。
参考文献
[1] Dehghani M, Gulvin S M, Flax J, et al. Systematic Evaluation of PKH Labelling on Extracellular Vesicle Size by Nanoparticle Tracking Analysis[J]. Scientific Reports, 2020,10(1).
[2] Morales-Kastresana A, Telford B, Musich T A, et al. Labeling Extracellular Vesicles for Nanoscale Flow Cytometry[J]. Sci Rep, 2017,7(1):1878.
[3] Pužar Dominkuš P, Stenovec M, Sitar S, et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes, 2018,1860(6):1350-1361.
[4] Li C P, Kim E Y, Badr C E, et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters[J]. Nature Communications, 2015,6(1).
[5] Caponnetto F, Manini I, Skrap M, et al. Size-dependent cellular uptake of exosomes[J]. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, 2017,13(3):1011-1020.
[6] Kulkarni S A, Feng S. Effects of Particle Size and Surface Modification on Cellular Uptake and Biodistribution of Polymeric Nanoparticles for Drug Delivery[J]. Pharmaceutical Research, 2013,30(10):2512-2522.
天津外泌体
天津外泌体科技有限公司是以外泌体药物装载及靶向输送为主的生物医药高科技企业。公司战略布局外泌体载药及靶向输送平台建设、外泌体原料开发、医疗器械创新研发三大业务板块,着力构建以高效稳定的药物偶联专利技术为核心的EXC载药平台、以外泌体自组装靶向引导技术为核心的TAD载药平台,建立外泌体产业竞争壁垒。
