请教real time PCR的RT部分能否使用传统半定量RT-PCR试剂盒的反转录部分?
丁香园论坛
2104
各位老师:
您们好!偶欲做几个基因的RT-PCR实验。偶先用传统的半定量两步法RT-PCR试剂盒(TaKaRa DRR019A)扩增了几个基因,并用该试剂盒反转录了不少cDNA。但还有2个基因偶打算用real time PCR法来扩增。拟采用TaKaRa DRR041S试剂盒。但是TaKaRa DRR041S试剂盒说明书上写的反转录步骤是使用另外一个单独的RT Reagents (TaKaRa DRR033A),得到cDNA再用TaKaRa DRR041S试剂盒扩增。但是仅一个RT Reagents (TaKaRa DRR033A)就要1500元,请问能否将半定量两步法RT-PCR试剂盒(TaKaRa DRR019A)制作的cDNA液体体系用于TaKaRa DRR041S试剂盒的real time扩增?因为这两种反转录体系有所不同(包括镁离子、dNTP等的量),得到的cDNA液体中各种物质的含量也会有所不同。这样套用不知行不行?两种反转录体系如下:
DRR019A的RT配方 使用量(ul) DRR033A的RT配方 使用量(ul)
MgCl2 2
10×RT Buffer 1 5×M-MLV Buffer 2
dNTP (各10mM) 1 dNTP (各10mM) 0.5
Random 9 mers 0.5 Random 6 mers 0.5
A-MLV RTase 0.5 M-MLV RTase 0.25
RNase Inhibitor 0.25 RNase Inhibitor 0.25
RNase Free dH2O 3.75 RNase Free dH2O Up to 10
Total RNA 1 Total RNA X
总体积 10 总体积 10
DRR033A的RT配方居然连镁离子都没有,是不是含在5×M-MLV Buffer中了?这2种体系(其实就是2种逆转录酶)的镁离子浓度差别有多大?能否造成扩增反应的不同?dNTP的量也差了一倍,能相互通用吗?恳请高手们解密!不甚感激!
您们好!偶欲做几个基因的RT-PCR实验。偶先用传统的半定量两步法RT-PCR试剂盒(TaKaRa DRR019A)扩增了几个基因,并用该试剂盒反转录了不少cDNA。但还有2个基因偶打算用real time PCR法来扩增。拟采用TaKaRa DRR041S试剂盒。但是TaKaRa DRR041S试剂盒说明书上写的反转录步骤是使用另外一个单独的RT Reagents (TaKaRa DRR033A),得到cDNA再用TaKaRa DRR041S试剂盒扩增。但是仅一个RT Reagents (TaKaRa DRR033A)就要1500元,请问能否将半定量两步法RT-PCR试剂盒(TaKaRa DRR019A)制作的cDNA液体体系用于TaKaRa DRR041S试剂盒的real time扩增?因为这两种反转录体系有所不同(包括镁离子、dNTP等的量),得到的cDNA液体中各种物质的含量也会有所不同。这样套用不知行不行?两种反转录体系如下:
DRR019A的RT配方 使用量(ul) DRR033A的RT配方 使用量(ul)
MgCl2 2
10×RT Buffer 1 5×M-MLV Buffer 2
dNTP (各10mM) 1 dNTP (各10mM) 0.5
Random 9 mers 0.5 Random 6 mers 0.5
A-MLV RTase 0.5 M-MLV RTase 0.25
RNase Inhibitor 0.25 RNase Inhibitor 0.25
RNase Free dH2O 3.75 RNase Free dH2O Up to 10
Total RNA 1 Total RNA X
总体积 10 总体积 10
DRR033A的RT配方居然连镁离子都没有,是不是含在5×M-MLV Buffer中了?这2种体系(其实就是2种逆转录酶)的镁离子浓度差别有多大?能否造成扩增反应的不同?dNTP的量也差了一倍,能相互通用吗?恳请高手们解密!不甚感激!