组织与细胞蛋白样品的制备

1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 组织和细胞的来源：
1.1.2 仪器 设备
机械组织匀浆器
低温高速离心机 (>40,000 g)
超速离心机
超生细胞破碎仪
超纯水装置


1.1.3 试剂
三氯醋酸 (TCA)
丙酮
二硫苏糖醇 (DTT)
尿素
CHAPS
PMSF
EDTA
乙醇
磷酸
考马斯亮蓝R350
抑肽素A
亮肽素

试剂 纯度均应是分析纯或以上。

1.1.4 溶液配制
(1) PBS：
NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na ₂ HPO ₄ 1.44 g, KH ₂ PO ₄ ，溶于800 ml水中，用HCl调pH至7.4，用纯水定容至1 L；
(2) EDTA 储存液：
18.61 g Na ₂ EDTA·2H ₂ O，溶于70 ml纯水中，用10 mol/L NaOH调节pH值至8.0 (约需2 g NaOH颗粒)，定容为100 ml。可高压灭菌后分装备用；
(3) 亮肽素储存液 (50 μg/ml，100×)
10 mg/ml溶于水，-75℃保存；使用时配成50 μg/ml储液，-20℃保存；
(4) 抑肽素储存液 (70 μg/ml，100×)
1 mg/ml溶于甲醇，-75℃保存；使用时配成70 μg/ml储液，-20℃保存；
(5) PMSF储存液 (10 mM, 100×):
17.4 mg PMSF，溶于1ml异丙醇中，-20℃ 保存。
(6) DTT 储存液 (1 M):
0.31 g DTT溶于2 ml H2O中，-20℃ 保存 (DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理，可过滤除菌)。
(7) 裂解液:
Lysis buffer A
(9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)

Lysis buffer B
(7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)
Lysis buffer C
40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2O
Lysis buffer D
(8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml)

Lysis buffer E
(5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)

Lysis buffer F
100 μL SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT, 25% v/v glycerol)
●CA、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。
(8) 蛋白酶抑制剂混合物[3]

	成分	终浓度
蛋白酶抑制剂混合物	PMSF	35 μg/ml or 1 mM
EDTA	0.3 mg/ml ( 1 mM )
抑肽素	0.7 μg/ml
亮肽素	0.5 μg/ml