【资源】组织与细胞蛋白样品的制备
丁香园论坛
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 组织和细胞的来源：
1.1.2 仪器设备
机械组织匀浆器
低温高速离心机 (>40,000 g)
超速离心机
超生细胞破碎仪
超纯水装置
1.1.3 试剂
三氯醋酸 (TCA)
丙酮
二硫苏糖醇 (DTT)
尿素
CHAPS
PMSF
EDTA
乙醇
磷酸
考马斯亮蓝R350
抑肽素A
亮肽素
试剂纯度均应是分析纯或以上。
1.1.4 溶液配制
(1) PBS：
NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4 1.44 g, KH2PO4，溶于800 ml水中，用HCl调pH至7.4，用纯水定容至1 L；
(2) EDTA 储存液：
18.61 g Na2EDTA·2H2O，溶于70 ml纯水中，用10 mol/L NaOH调节pH值至8.0 (约需2 g NaOH颗粒)，定容为100 ml。可高压灭菌后分装备用；
(3) 亮肽素储存液 (50 μg/ml，100×)
10 mg/ml溶于水，-75℃保存；使用时配成50 μg/ml储液，-20℃保存；
(4) 抑肽素储存液 (70 μg/ml，100×)
1 mg/ml溶于甲醇，-75℃保存；使用时配成70 μg/ml储液，-20℃保存；
(5) PMSF储存液 (10 mM, 100×):
17.4 mg PMSF，溶于1ml异丙醇中，-20℃ 保存。
(6) DTT 储存液 (1 M):
0.31 g DTT溶于2 ml H2O中，-20℃ 保存 (DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理，可过滤除菌)。
(7) 裂解液:
Lysis buffer A
(9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)
Lysis buffer B
(7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)
Lysis buffer C
40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2O
Lysis buffer D
(8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml)
Lysis buffer E
(5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)
Lysis buffer F
100 μL SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT, 25% v/v glycerol)
CA、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。
(8) 蛋白酶抑制剂混合物[3]
成分
终浓度
蛋白酶抑制剂混合物
PMSF
35 μg/ml or 1 mM
EDTA
0.3 mg/ml (1 mM)
抑肽素
0.7 μg/ml
亮肽素
0.5 μg/ml
1.2 方法
1.1.1组织蛋白提取方法
1.2.1.1三氯醋酸/丙酮沉淀法[1]
(1)冰上取材，称湿重，置液氮中冻存或直接进行下一步；
(2)在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织；
(3)将粉末悬浮于含DTT(0.2%w/v)的10%三氯醋酸（w/v）的丙酮溶液中；
(4)蛋白–20℃沉淀过夜；
(5)35000×g(6℃)离心30min；
(6)将沉淀重悬于含0.2%DTT的预冷丙酮中；
(7)-20℃放置1h；
(8)35000×g(6℃)离心30min；
(9)在通风橱中让丙酮充分挥发，得到干燥的沉淀；
(10)在裂解液中重新溶解沉淀（50-100mg组织需要1ml裂解液）；
(11)15℃,40000×g，离心1hr；
(12)用Bradford法[2]测定上清的蛋白浓度，分装后置–75℃保存。
1.2.1.2超速离心法
(1)取材；
(2)用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每1g样品加入0.5ml裂解液，使用组织匀浆器匀浆30s；
(3)组织悬液15℃，10000×g离心10min；
(4)上清液4℃，150000×g超速离心45min；
(5)小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心上清6℃40,000g再次离心50min；
(6)取离心上清。Bradford法定量，分装后置–75℃保存。
1.2.2培养细胞蛋白提取
1.2.2.1循环冻融法
(1)吸出培养液弃去，0.01mol/LPBS洗一次；
(2)加入PBS，用橡胶刮收集细胞于10ml离心管中；
(3)500×g，离心5min；
(4)弃上清，PBS洗三次（室温,500×g，5min），
(5)在离心管中加入1mlPBS，重悬细胞，用1ml微量加液器移入Eppendorf管中；
(6)执行Biofuge存储程序8，500×g5min离心；
(7)用200μl微量加液器吸出PBS，弃去；
(8)吸干残留的PBS，估计样品体积，加入5倍体积裂解液，巴氏滴管混匀，液氮中反复冻融三次(每次置液氮中3s，室温融化)，DTT在第一次冻融后加入；
(9)执行Biofuge存储程序6，15℃，40000×g，离心1hr(Biofuge)；
(10)上清Bradford法定量，沉淀-75℃保存备用。
1.2.2.2超声破碎法
(1)取对数生长期的细胞，吸出培养液弃去，0.01mol/LPBS洗一次；
(2)加入PBS，用橡胶刮收集细胞于10ml离心管中；
(3)室温，500×g，离心5min；
(4)弃上清，PBS洗3次（室温,500×g，5min）；
(5)在离心管中加入1mlPBS，重悬细胞，用1ml微量加液器移入Eppendorf管中，500×g离心5min；
(6)吸干残留的PBS，估计样品体积，加入5倍体积裂解液，混匀，移入1.5mlEppendorf管中，冰浴中以最大功率超声破碎细胞（3×10s）；
(7)15℃,40000×g，离心1hr(Biofuge)；
(8)上清Bradford法定量，沉淀-75℃保存备用。
2结果和讨论
蛋白质提取的基本步骤包括清洗组织或细胞、裂解细胞、离心除去膜组分等获得溶解的蛋白质上清。
我们破碎细胞采用循环冻融法和超声波法；破碎组织采用液氮研磨法和机械匀浆法。循环冻融法操作简便，比较适合提取培养细胞的稳定蛋白，我们后期实验对培养细胞主要采取这种破碎方式。使用超声破碎必须注意的是控制强度在一定限度，即刚好低于溶液产生泡沫的水平。因为产生泡沫会导致蛋白质变性，同时要注意散热。匀浆是机体软组织破碎最常用的方法之一。由于匀浆过程中蛋白质被蛋白酶降解的可能性较小，所以匀浆是简便、迅速和风险小的组织破碎方法，我们实验室在破碎脑和脊髓组织时常用此法；由于神经组织比较柔软，液氮研磨法也很适合，本实验中我们使用了这一方法破碎大鼠脊髓组织，中枢神经组织由于富含脂类，沉淀法和高速离心法可以使蛋白和脂类干扰物质有效分离，但沉淀法的缺点是再溶解时蛋白损失严重。高速离心的缺点是需要样品量大，如BeckmanL7-65超速离心机的离心管容量为8ml，不适用小量样品的制备。
在众多的裂解液配方中，我们主要采用9M尿素,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%两性电解质加蛋白酶抑制剂混合物，原因是这一配方经长期使用很稳定，裂解效率也较高，非常适合小量细胞蛋白提取要求。针对富脂的中枢神经组织中脂类物质与蛋白相互作用，高浓度的尿素可以造成强变性条件(但如果再提高尿素浓度，尿素就容易析出，影响蛋白的溶解)，过量的去污剂也可以减少脂类的污染，两性电解质可以提高蛋白的溶解度，同时有利于等待聚焦。早期我们加入Tris碱以防止蛋白的水解，但是由于盐离子的引入，导致IEF电压过低，影响聚焦。
详细内容见附件
1.1 材料
1.1.1 组织和细胞的来源：
1.1.2 仪器设备
机械组织匀浆器
低温高速离心机 (>40,000 g)
超速离心机
超生细胞破碎仪
超纯水装置
1.1.3 试剂
三氯醋酸 (TCA)
丙酮
二硫苏糖醇 (DTT)
尿素
CHAPS
PMSF
EDTA
乙醇
磷酸
考马斯亮蓝R350
抑肽素A
亮肽素
试剂纯度均应是分析纯或以上。
1.1.4 溶液配制
(1) PBS：
NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4 1.44 g, KH2PO4，溶于800 ml水中，用HCl调pH至7.4，用纯水定容至1 L；
(2) EDTA 储存液：
18.61 g Na2EDTA·2H2O，溶于70 ml纯水中，用10 mol/L NaOH调节pH值至8.0 (约需2 g NaOH颗粒)，定容为100 ml。可高压灭菌后分装备用；
(3) 亮肽素储存液 (50 μg/ml，100×)
10 mg/ml溶于水，-75℃保存；使用时配成50 μg/ml储液，-20℃保存；
(4) 抑肽素储存液 (70 μg/ml，100×)
1 mg/ml溶于甲醇，-75℃保存；使用时配成70 μg/ml储液，-20℃保存；
(5) PMSF储存液 (10 mM, 100×):
17.4 mg PMSF，溶于1ml异丙醇中，-20℃ 保存。
(6) DTT 储存液 (1 M):
0.31 g DTT溶于2 ml H2O中，-20℃ 保存 (DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理，可过滤除菌)。
(7) 裂解液:
Lysis buffer A
(9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)
Lysis buffer B
(7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)
Lysis buffer C
40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2O
Lysis buffer D
(8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml)
Lysis buffer E
(5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)
Lysis buffer F
100 μL SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT, 25% v/v glycerol)
CA、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。
(8) 蛋白酶抑制剂混合物[3]
成分
终浓度
蛋白酶抑制剂混合物
PMSF
35 μg/ml or 1 mM
EDTA
0.3 mg/ml (1 mM)
抑肽素
0.7 μg/ml
亮肽素
0.5 μg/ml
1.2 方法
1.1.1组织蛋白提取方法
1.2.1.1三氯醋酸/丙酮沉淀法[1]
(1)冰上取材，称湿重，置液氮中冻存或直接进行下一步；
(2)在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织；
(3)将粉末悬浮于含DTT(0.2%w/v)的10%三氯醋酸（w/v）的丙酮溶液中；
(4)蛋白–20℃沉淀过夜；
(5)35000×g(6℃)离心30min；
(6)将沉淀重悬于含0.2%DTT的预冷丙酮中；
(7)-20℃放置1h；
(8)35000×g(6℃)离心30min；
(9)在通风橱中让丙酮充分挥发，得到干燥的沉淀；
(10)在裂解液中重新溶解沉淀（50-100mg组织需要1ml裂解液）；
(11)15℃,40000×g，离心1hr；
(12)用Bradford法[2]测定上清的蛋白浓度，分装后置–75℃保存。
1.2.1.2超速离心法
(1)取材；
(2)用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每1g样品加入0.5ml裂解液，使用组织匀浆器匀浆30s；
(3)组织悬液15℃，10000×g离心10min；
(4)上清液4℃，150000×g超速离心45min；
(5)小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心上清6℃40,000g再次离心50min；
(6)取离心上清。Bradford法定量，分装后置–75℃保存。
1.2.2培养细胞蛋白提取
1.2.2.1循环冻融法
(1)吸出培养液弃去，0.01mol/LPBS洗一次；
(2)加入PBS，用橡胶刮收集细胞于10ml离心管中；
(3)500×g，离心5min；
(4)弃上清，PBS洗三次（室温,500×g，5min），
(5)在离心管中加入1mlPBS，重悬细胞，用1ml微量加液器移入Eppendorf管中；
(6)执行Biofuge存储程序8，500×g5min离心；
(7)用200μl微量加液器吸出PBS，弃去；
(8)吸干残留的PBS，估计样品体积，加入5倍体积裂解液，巴氏滴管混匀，液氮中反复冻融三次(每次置液氮中3s，室温融化)，DTT在第一次冻融后加入；
(9)执行Biofuge存储程序6，15℃，40000×g，离心1hr(Biofuge)；
(10)上清Bradford法定量，沉淀-75℃保存备用。
1.2.2.2超声破碎法
(1)取对数生长期的细胞，吸出培养液弃去，0.01mol/LPBS洗一次；
(2)加入PBS，用橡胶刮收集细胞于10ml离心管中；
(3)室温，500×g，离心5min；
(4)弃上清，PBS洗3次（室温,500×g，5min）；
(5)在离心管中加入1mlPBS，重悬细胞，用1ml微量加液器移入Eppendorf管中，500×g离心5min；
(6)吸干残留的PBS，估计样品体积，加入5倍体积裂解液，混匀，移入1.5mlEppendorf管中，冰浴中以最大功率超声破碎细胞（3×10s）；
(7)15℃,40000×g，离心1hr(Biofuge)；
(8)上清Bradford法定量，沉淀-75℃保存备用。
2结果和讨论
蛋白质提取的基本步骤包括清洗组织或细胞、裂解细胞、离心除去膜组分等获得溶解的蛋白质上清。
我们破碎细胞采用循环冻融法和超声波法；破碎组织采用液氮研磨法和机械匀浆法。循环冻融法操作简便，比较适合提取培养细胞的稳定蛋白，我们后期实验对培养细胞主要采取这种破碎方式。使用超声破碎必须注意的是控制强度在一定限度，即刚好低于溶液产生泡沫的水平。因为产生泡沫会导致蛋白质变性，同时要注意散热。匀浆是机体软组织破碎最常用的方法之一。由于匀浆过程中蛋白质被蛋白酶降解的可能性较小，所以匀浆是简便、迅速和风险小的组织破碎方法，我们实验室在破碎脑和脊髓组织时常用此法；由于神经组织比较柔软，液氮研磨法也很适合，本实验中我们使用了这一方法破碎大鼠脊髓组织，中枢神经组织由于富含脂类，沉淀法和高速离心法可以使蛋白和脂类干扰物质有效分离，但沉淀法的缺点是再溶解时蛋白损失严重。高速离心的缺点是需要样品量大，如BeckmanL7-65超速离心机的离心管容量为8ml，不适用小量样品的制备。
在众多的裂解液配方中，我们主要采用9M尿素,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%两性电解质加蛋白酶抑制剂混合物，原因是这一配方经长期使用很稳定，裂解效率也较高，非常适合小量细胞蛋白提取要求。针对富脂的中枢神经组织中脂类物质与蛋白相互作用，高浓度的尿素可以造成强变性条件(但如果再提高尿素浓度，尿素就容易析出，影响蛋白的溶解)，过量的去污剂也可以减少脂类的污染，两性电解质可以提高蛋白的溶解度，同时有利于等待聚焦。早期我们加入Tris碱以防止蛋白的水解，但是由于盐离子的引入，导致IEF电压过低，影响聚焦。
详细内容见附件
