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1. PBS 溶解抗原为 30 μ g/ml，加 100 μ l/孔于 PVDF 膜铺底的 96 孔灭菌板过夜；
2. 第二天吸去包被液后，加 5％FCS 的 PRMI 1640 培养基 100 μ l 封闭 1 小时，37℃；
3. 准备脾细胞悬液（用氯化铵去除红细胞，制备成单个脾淋巴细胞悬液） ；
4. 从 1 × 106/ 孔开始，按 1:3的稀释度开始逐孔稀释做不同浓度梯度，并做 3 个复孔，37 ℃ 静置培养 5 小时；
5. PBS 洗 3～5 次，生物素化的抗鼠 IgG二抗孵育 30 min；
6. PBS 洗 3～5 次，链亲和素标记的碱性磷酸酶孵育 30 min；
7. PBS 洗 3～5 次，用底物BCIP/NBT显色，显微镜下观察显色反应，显色后及时终止反应；
8. 计数每孔中的斑点数目，计算每 106 个脾细胞中抗体分泌细胞数量。
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