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ELISPOT实验操作中应注意哪些问题?

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酶联免疫斑点法(ELISpot)

ELISPOT 技术操作中应注意的问题:

(1) 关于固相支持物(微量板) 的选择, 目前有 96 孔聚乙烯板和硝酸纤维素膜微量板(NC) 两种, 均为通过非共价键吸附抗原 或抗体。在实验中, 用NC做支持物时, 背景颜色较深, 不利于 对比, 但用聚乙烯做支持物时, 偶有斑点大小不 均或融合现象, 这时使用琼脂糖固相颗粒时即可避 免这种现象, 且结合面积大, 对比鲜明, 故目前作者 采用聚乙烯微量板, 试剂盒购自法国DIACLON E 公司(ELISPOT-琼脂糖法) , 实验结果较理想。

(2) 每次洗板后均要求在无菌吸水纸上反复拍打, 减少液体残留以除去过多及结合不牢固抗体。

(3) 严格按试验流程操作, 抗体、抗原稀释到要求浓度,作者认为最佳抗体终浓度为10 µg/mL , 最佳抗原 终浓度为20 µg/mL 。浓度过高易形成不稳定的多层吸附, 过低会残留未结合空间, 均影响灵敏度 和特异性。

(4) 保证培养时间及温度、湿度, 以利反 应充分进行。经过长时间试验观察对比, 作者认为 最佳培养时间为36 h。

(5) 斑点数量太多肉眼 计数困难时, 可利用计算机自动图像分析系统计 数 , 可提高准确性。

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