人VL基因文库的构建

[器材和试剂]

●  PCR试剂和设备

●  cFv基因文库单链模板DNA,制备自pHENl中的天然scFv文库（10ng/u1）

●  Gelleclean试剂盒（Qbiogene）

●  Wtzard PCR纯化试剂盒（ProlneSa）

●  RJHl/2Xho引物：  5'-GGC ACC CTG GTC ACC GTC TCG AGT GGT GGA-3'

●  RJH3Xho引物：  5'-GGG ACA ATG GTC ACC GTC TCG AGT GGT GGA-3'

●  RJH4/5Xho引物：  5'-GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCG AGT GGT GGA-3'

●  RJH6Xho引物：  5'-GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCG AGT GGT GGA-3'

●  FdSEQl引物

●  pHENl-Vλ3载体DNA（可以根据 MTA）

[方法]

1. 配制4个独立的50ul PCR反应混合液，  包含：

●  水，35.5ul

●  20XdNTP（每种5mmol/L），2.5ul

●  10XVent聚合酶缓冲液，5.0ul

●  FdSEQl引物  （10pmol/u1），2.5ul

●  反向引物（10pmol/u1），2.5ul

●  单链scFv模板DNA（10ng），1.0ul

●  Vent DNA聚合酶（2单位），1.0ul

2. 在有加热盖的热循环仪内加热反应混合液到94℃5分钟。

3. 以94℃30秒、42℃30秒、72℃1分钟的条件共循环25次，扩增VL基因。

4. 用Wizard PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。

5. 用XhoI和NotI消化PCR产物；但除了用XhoI替代 NcoI,还需用NEB2缓冲液和BSA,按照厂家要求进行。

6. 用XhoI和NotI消化pHENl-VL3载体DNA;但不要用XhoI替代NcoI.

7. 连接已消化的PCR产物和已消化的载体，并电转化到大肠杆菌TGl细胞中，构建4个VL基因噬菌体文库。测定文库容量并将细菌性文库材料储存于-70℃。

8. 用含甘油文库储存材料细菌接种到含100ug/ml氨苄青霉素和1%葡萄糖的100ml 2X TY培养基中，制备每种VL基因文库DNA.接种量应足够大以保证接种细菌数至少比文库容量大5倍。过夜培养后，按标准的DNA质粒制备方法进行操作。为了续后进行文库消化，可合并不同文库的DNA.