PCR剪接VHCDR3基因文库和VL基因构建scFv基因文库

[器材和试剂]

Winard PCR纯化试剂盒 （Promega）

PCR试剂和设备

用于连接scFv和pHENl DNA以及将scFv文库电转化到大肠杆菌TGl株的试剂和设备 FDSEQ引物

扩增的VHCDR3基因文库和VL基因，

[方法]

1. 配制4个25ulPCR反应液，包含：

去离子水，10.25ul

10×Vent缓冲液，2.5ul

20×dNTP（每种5mmol/L）， 1.25ul

VH文库DNA（200ng），l 0ul

VL基因DNA（200ng）， 5.0ul

VentDNA聚合酶（2单位），1.0ul

在有加热盖PCR仪中以94℃1.5分钟、65℃1.5分针、72℃1,5分钟无扩增循环7次，连接片段。

2. 7次循环后，保持在94℃，添加含有旁侧引物的25ul混合液：

去离子水，15.2ul

10×Vent缓冲液，2.5ul

20×dNTP（每种5mmol/L）， 1.3ul

FdSEQ引物 （10pmol/u1）， 2.5ul

LMB3引物（10pmmol/ul），2.5ul

VentDNA聚合酶（2单位），1.0ul

3. 以94℃1分钟、42℃1分钟、72℃2分钟的条件共循环30次，剪接片段。用Wlnard PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。

4. 用NcoI和NotI消化PCR产物。

5. 将消化的PCR产物连接到NcoI/NotI消化的pHENl中，并电转化到大肠杆菌TGl细胞，用于VHCDR3多样化的引物定位和设计。

VHCDR3多样化所需引物是根据拟亲和力成熟抗体的V基因序列进行设计的。例中，VHCDR3（下划线区域）中7个氨甚酸被随机化。框架3 （FR3）末端和框架4（FR4）起始端用实线标出