GST融合蛋白纯化方法

GST融合蛋白纯化方法

1 目的片段接入pGEX载体；

2 涂板，挑单克隆，摇菌至OD600≈1.0，加入IPTG（终浓度1 mM）诱导6－8 h；

3 收菌，每升菌液约以50 mL PBS重悬，加入1%Triton X-100（v/v），1％β-巯基乙醇（v/v），PMSF（终浓度1 mM）；

以下步骤均在冰上操作：

4 超声破碎菌体，15000 g，10min离心取上清，在上清中加入适量GST-beads，轻轻晃动令其吸附蛋白1 h；

5 2000 g，3min离心弃上清；

6 加入至少10倍体积PBS，轻摇至beads悬浮于溶液中，2000 g，3 min离心弃上清；

7 重复步骤6 两次；

8 加入1 mL GST Elution Buffer，轻摇10 min；

9 2000 g，3 min离心，收集上清；

10 重复步骤8-9至少两次；

11 SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，Bradford法检测蛋白浓度；

12 将蛋白置于-20℃保存。

P.S. 大量提取前应取少量菌液，改变IPTG浓度，诱导温度，诱导时间等，以确定蛋白表达的最适条件。