关于融合蛋白纯化的问题？

1、操作尽可能置于冰上或者在冷库内进行。

2、不要太稀，蛋白浓度维持在μg/mL～mg/mL。

3、合适的pH，除非是进行聚焦层析，所使用的缓冲溶液pH避免与pI相同，防止蛋白质的沉淀。

4、使用蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶对目标蛋白的降解;在纯化细胞中的蛋白质时，加入DNA酶，降解DNA，防止DNA对蛋白的污染。

5、避免样品反复冻融和剧烈搅动，以防蛋白质的变性。

6、缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环境。

7、在缓冲溶液中加入0.1~1mmol/L DTT(或β-巯基乙醇)，防止蛋白质的氧化。

8、加1~10mmol/L EDTA金属螯合剂，防止重金属对目标蛋白的破坏。

9、使用灭菌溶液，防止微生物生长。

可以加点甘油或者乙二醇降低极性，这样溶解就会好得多，此外也直接加2%得PEG这样也降低极性，同时保护蛋白，再做纯化就可以了，以前遇到这样得蛋白是用10%得乙醇加3-5%得PEG5000，这样得情况下蛋白还是活性回收率很高，那些表面活性剂能不用还是不用得好，失去活性可以监测一下提取，纯化，酶切到底哪里失去了活性，这样更容易解决你得问题。