光敏生物素核酸探针原位杂交组化程序

互联网2013-09-06

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　　（1）石蜡切片脱蜡入水后，置0.1mol/l PBS pH7.2冲洗5min；冰冻切片直接入PBS冲洗5min。
　　（2）0.1mol/l 甘氨酸PBS冲洗5min。
　　（3）0.4%Trition X-100 PBS 冲洗15min。
　　（4）蛋白酶K1μg/ml（0.1mol/l Tris �HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA配）37℃保温30min。
　　（5）4%多聚甲醛PBS固定5min。
　　（6）0.1mol/l PBS冲洗2×3min。
　　（7）0.25%乙酸酐（0.1mol/l 三乙醇胺配制）10min。
　　（8）2×SSC冲洗10min（1×SSC：0.15mol/l NaCl, 0.015mol/L 柠檬酸钠）。
　　（9）取10μl含相应探针的杂交液滴于标本上，如果是cDNA探针则用前将探针于95℃水浴中保温10min，马上放入冰浴中冷却，然后再用。
　　（10）盖上22×22mm的硅化盖片或合适大小的蜡膜，入温盒43℃保温12～16h。
　　（11）4×SSC洗脱盖片，并在同一液中37℃漂洗10～30min。
　　（12）2×SSC（含20μg/mlRNaseA, 适于RNA探针）冲洗30min，37℃。
　　（13）1×SSC，0.1×SSC,37℃各漂洗10～30min。
　　（14）0.05mol/l PBS 冲洗4×5min。
　　（15）3%BSA（0.4%Triton X-100 PBS配）37℃保温30min。
　　（16）Avidin �AKP(碱性磷酸酶)（1：500～1：100，0.4%Triton X-100 PBS配）室温1～3h。
　　（17）0.05mol/l PBS冲洗4×5min。
　　（18）TSM1冲洗2×5min。
　　（19）TSM2冲洗2×5min。
　　（20）硝基四氮唑蓝（NBT）0.4%mg/ml 和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸（BCIP）0.2mg/ml混合液显色，室温，暗处3h。
　　（21）20mmol/l EDTA,pH8.0终止显色。
　　（22）甘油明胶直接封片。

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