光敏生物素试剂盒杂交实验
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实验试剂
硫酸葡聚糖钠盐(可不用)、聚乙烯吡赂啉酮（PVP）、聚蔗糖、牛血清白蛋白（BSA）、100mM EDTA、3MnaAC、无水乙醇、电泳缓冲液、切变性鲱鱼精DNA（100ug/ml）
柠檬酸三钠 0.3M （含100ug/ul变性鲱鱼精DNA）
变性液 0.5M NaOH 中和液 1M Tris-HCl pH 7.4
50×Denhardt's 溶液 1％PVP 1M PBS NaCl 0.8% pH 7.4
A: 2×SSC，250ml中含0.1%SDS B：0.1×SSC，250ml中含0.1%SDS
C：Tris-HCl 100mM pH 7.5 D：Tris-HCl 100mM
MgCl2 2mM Tween 20 0.5% pH 7.5
底物溶液 Tris-HCl 100mM pH 9.5 终止液
实验设备
实验步骤
3) 脱嘌啉0.25NHCl浸泡凝胶10分钟，蒸馏水洗胶（大于15kb的DNA片段转移时做此步骤）
4) 变性，变性液（0.5MNaOH、1.5MNaCl）浸泡凝胶2次，每次15分钟，蒸馏水洗胶
5) 中和，中和液（0.5MTris-HCl，pH7.0、3MNACl）浸泡凝胶2次，每次15分钟，蒸馏水洗胶
7) 转膜，取一塑料盒，将一干净玻璃板横架于盒上，盒中倒入10×SSC，作为转移缓冲液，将2张大小合适的滤纸用20×SSC溶液浸湿，放置于玻璃板上，作为滤纸桥
将处理好的凝胶切去多余部分并切下一角作标记，胶面反转放置于滤纸桥上，四周用Parafilm膜封闭，以防短路
剪取一块面积稍大于凝胶的硝酸纤维素膜（NC膜），以2×SSC溶液浸湿后置于凝胶上
滤纸上面放一叠吸水纸，上面压一块玻璃板，再压上500g左右的重物，转移过夜
8) 烤膜，转移结束后，NC膜在与凝胶切角相对处，用铅笔做记号，用6×SSC溶液室温漂洗5分钟，以充分洗去沾上的凝胶成分，吸水纸吸干残余液体，室温晾干，NC膜用滤纸夹裹好，80℃烤膜2小时
1) 封闭，将杂交好的NC膜用滤纸吸干，放入一新杂交袋中，用封闭液４２℃封闭２－４小时（封闭液用量为４ml/50cm2 膜）。
2) 预杂交，将上部浸润的NC膜装入杂交袋，加入预杂交液（0.2ml/cm2 膜），使膜与预杂交液充分混匀，赶走汽泡，封口。65℃２－４小时。
3) 杂交，倾出预杂交液，加入杂交液（预杂交液＋临用前变性的标记好探针，终浓度为1-2ng/ml）（0.2ml/cm2 膜），65℃过夜。
4) 洗膜，用洗涤液Ａ，Ｂ分别洗膜两次，每次洗膜液体积不少于250ml。
5) 反应，弃去封闭液，加入亲和素－碱性磷酸酶溶液，室温避光反应１５分钟，轻轻震荡。取出膜，用洗涤液Ｃ，Ｄ分别洗涤三次，每次洗涤体积不应少于300ml，每次5分钟，振荡。
6) 显色，将膜转入新袋中，加入底物溶液（用量为４ml/50cm2 膜）。封袋，避光放置，显色数分钟至数小时，以杂交带清晰，背景低为好。
注意事项
