光敏生物素试剂盒杂交实验

实验试剂

硫酸葡聚糖钠盐(可不用)、聚乙烯吡赂啉酮（PVP）、聚蔗糖、牛血清白蛋白（BSA）、100mM EDTA、3MnaAC、无水乙醇、电泳缓冲液、切变性鲱鱼精DNA（100ug/ml）

20×SSC溶液 氯化钠 3M 预杂交液 6×SSC

柠檬酸三钠 0.3M （含100ug/ul变性鲱鱼精DNA）

pH 7.0 5×Denhardt's 溶液

0.5%SDS

变性液 0.5M NaOH 中和液 1M Tris-HCl pH 7.4

1.5M NaCl 1.5M NaCl

封闭液 3gBSA溶于70ml水中，浓盐酸调pH至3.0，煮沸20分钟后，冷至室温，NaOH调pH至7.5，加入10ml以下缓冲液（1M Tris-HCl pH7.5，MgCl₂ 0.19%，NaCL 5.8%，Triton X-100 0.05ml）定容至100ml

50×Denhardt's 溶液 1％PVP 1M PBS NaCl 0.8% pH 7.4

1%BSA KCl 0.02%

1%聚蔗糖 Na₂ HPO₄ 0.144%

KH₂ PO₄ 0.024%

洗涤液

A: 2×SSC，250ml中含0.1%SDS B：0.1×SSC，250ml中含0.1%SDS

C：Tris-HCl 100mM pH 7.5 D：Tris-HCl 100mM

NaCl 1M NaCl 0.5M

MgCl₂ 2mM Tween 20 0.5% pH 7.5

Triton X-100 0.05%

亲和素－碱性磷酸酶溶液 Tris-HCl 100mM

NaCl 1M

MgCl₂ 2mM

Triton X-100 0.05%

pH 7.5

碱性磷酸酶 2-3单位/ml

底物溶液 Tris-HCl 100mM pH 9.5 终止液

NaCl 100mM Tris-HCl 10mM

MgCl₂ 5mM EDTA 1mM

实验设备

分子杂交仪、摇床、 烤箱、取液器、电泳仪、电泳槽

实验步骤

1. 转膜

1) 电泳

2) 切胶 在紫外下，切取凝胶有条带部分

3) 脱嘌啉0.25NHCl浸泡凝胶10分钟，蒸馏水洗胶（大于15kb的DNA片段转移时做此步骤）

4) 变性，变性液（0.5MNaOH、1.5MNaCl）浸泡凝胶2次，每次15分钟，蒸馏水洗胶

5) 中和，中和液（0.5MTris-HCl，pH7.0、3MNACl）浸泡凝胶2次，每次15分钟，蒸馏水洗胶

6) 平衡，凝胶在20×SSC中室温平衡10分钟

7) 转膜，取一塑料盒，将一干净玻璃板横架于盒上，盒中倒入10×SSC，作为转移缓冲液，将2张大小合适的滤纸用20×SSC溶液浸湿，放置于玻璃板上，作为滤纸桥

将处理好的凝胶切去多余部分并切下一角作标记，胶面反转放置于滤纸桥上，四周用Parafilm膜封闭，以防短路

剪取一块面积稍大于凝胶的硝酸纤维素膜（NC膜），以2×SSC溶液浸湿后置于凝胶上

剪取2块相应大小的滤纸，以2×SSC溶液浸湿后置于NC膜上

（滤纸、凝胶、NC膜、滤纸间都不能有气泡）

滤纸上面放一叠吸水纸，上面压一块玻璃板，再压上500g左右的重物，转移过夜

8) 烤膜，转移结束后，NC膜在与凝胶切角相对处，用铅笔做记号，用6×SSC溶液室温漂洗5分钟，以充分洗去沾上的凝胶成分，吸水纸吸干残余液体，室温晾干，NC膜用滤纸夹裹好，80℃烤膜2小时

9) 烤干的NC膜用２×SSC浸润。

2. 杂交

1) 封闭，将杂交好的NC膜用滤纸吸干，放入一新杂交袋中，用封闭液４２℃封闭２－４小时（封闭液用量为４ml/50cm² 膜）。

2) 预杂交，将上部浸润的NC膜装入杂交袋，加入预杂交液（0.2ml/cm² 膜），使膜与预杂交液充分混匀，赶走汽泡，封口。65℃２－４小时。

3) 杂交，倾出预杂交液，加入杂交液（预杂交液＋临用前变性的标记好探针，终浓度为1-2ng/ml）（0.2ml/cm² 膜），65℃过夜。

4) 洗膜，用洗涤液Ａ，Ｂ分别洗膜两次，每次洗膜液体积不少于250ml。

5) 反应，弃去封闭液，加入亲和素－碱性磷酸酶溶液，室温避光反应１５分钟，轻轻震荡。取出膜，用洗涤液Ｃ，Ｄ分别洗涤三次，每次洗涤体积不应少于300ml，每次5分钟，振荡。

6) 显色，将膜转入新袋中，加入底物溶液（用量为４ml/50cm² 膜）。封袋，避光放置，显色数分钟至数小时，以杂交带清晰，背景低为好。

注意事项

1. 在７操作中每层间应确保无汽泡存在。

2. 操作中吸水纸的大小应小于顶层滤纸，且不能于滤纸下的任何一层接触。

3. 烤片的作用在于使已转移条带更牢地结合于NC膜上。